背景现状及研究的目的意义目前,肺癌位居全世界死亡率和发病率很高的恶性肿瘤之一。按病理组织学,分为小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non small celllung cancer,NSCLC),其中大约80%是NSCLC。由于NSCLC早期的临床症状和体征不明显,大概2/3的NSCLC患者在确诊时就已经失去手术根治的机会。由于传统的化疗药物和放疗治疗不能获得很好的疗效,NSCLC自诊断之后的5年生存率只有10%-15%。因此选择合适高效的的治疗方式实施个体化的治疗模式,成为目前肿瘤治疗领域的主要发展方向。近年来,伴随着精准医疗(precision medicine)理念登上医学治疗领域的舞台,程序性死亡分子1(programmed cell death-1,PD-1)/程序性死亡分子配体1(programmed cell death-1 ligand,PD-L1)逐渐成为医学免疫治疗领域广受关注的治疗靶点。PD-1/PD-L1通过免疫逃逸、抑制免疫应答、杀伤等方式,增强了肿瘤微环境的抵抗作用。随着对PD-1/PD-L1信号通路系统在NSCLC发生发展机制研究的突破,人们渐渐开启了对PD-1/PD-L1免疫检查点特异性阻滞剂的临床研究应用,其中以nivolumab,pembrolizumab为先锋的抗PD-1单抗进入了多项临床研究,并且在晚期NSCLC患者中取得显著的生存获益。大量相关的医学临床研究均表明PD1/PD-L1免疫抑制剂让PD-L1表达阳性的NSCLC患者明显获益。考虑到高昂的费用和该制剂的毒副作用,我们迫切需要有效的检测方法来帮助我们快速地区分和筛选出对该制剂有效的优势人群。然而原发肿瘤组织标本的检测存在原发肿瘤病灶和转移病灶之间的异质性问题,即原发肿瘤病灶并不能完全反映转移病病灶乃至全身肿瘤负荷的生物特性。同时,无论是原发病灶还是转移病灶,为了获得PD-L1蛋白的表达情况,均需要进行活检穿刺标本进行相关的靶点检测。穿刺的有创性以及病人难以耐受等原因常常导致实施检测的难度。此外,据很多相关研究报道,从原发肿瘤病灶脱落的肿瘤细胞在发生进展过程中经历着基因的变异以及蛋白表达的变异,因此,实施肿瘤组织基因的动态检测有助于对疾病发生发展的理解和研究,也有助于及时发现新出现的最新靶点,从而有助于临床工作者提出切实可行的治疗方案。因此,围绕着解决这一系列问题,本次课题探讨检测NSCLC循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)PD-L1 的可行性。CTC 的概念是在 1869 年由澳大利亚籍学者Ashworth第一次提出。在1976年Nowell将CTC的定义修正为:来源于原发肿瘤病灶或转移的肿瘤灶,获得脱离基底膜的能力并通过入侵组织基质进入血管内的肿瘤细胞。目前的CTC概念是指,存在于外周血中所有肿瘤细胞的统称。脱落进入血液里的肿瘤细胞,大部分会被吞噬消灭,而仅有少部分会生存下来并聚集为集落,在最后形成肿瘤的转移病灶。因此,CTC和转移病灶的形成密切相关,而致使肿瘤患者死亡的最主要的原因常常是肿瘤的转移。原发肿瘤可以产生多个转移病灶,而多个转移病灶就有可能具有不同的生物信息和特征,因此CTC就在一定程度上反映了从原发肿瘤病灶到转移肿瘤病灶的比较全面的生物信息,就仿佛是绘制了一幅全身各部分肿瘤病灶的图谱,反映各部位的生物学信息。这些信息有助于临床工作者针对患者的全身系统寻找到合适的药物靶点。本次课题就旨在探讨强生公司生产的被FDA唯一批准的可用于CTC检测的仪器(Cellsearch)对NSCLC病人CTC中PD-L1蛋白进行检测的可行性。由于标本的容易获得,也能做到实时动态监测。到目前为止,关于癌症病人CTC中PD-L1蛋白的检测全球鲜有报道。本研究有助于开拓CTC液体活检的领域,为临床治疗提供新的检测方法。方法应用实时荧光 PCR 法(Real-time PCR,qRT-PCR)检测 PD-L1 在 mRNA水平不同表达梯度的肺癌细胞系,然后用流式细胞仪验证PD-L1蛋白在蛋白水平的表达情况。将相应的肿瘤细胞计数后加入健康人血液,用Cellsearch进行检测,证实了 Cellsearch对循环肿瘤细胞中PD-L1蛋白进行检测的可行性。进一步明确选出最佳的抗体和相应的最佳抗体浓度。最后,通过筛选获得的肺癌细胞系,得到相应的PD-L1不同表达强度的阳性信号参照标准。建立完善方法后,对20例NSCLC患者进行了 CTC以及CTC中PD-L1蛋白的检测。结果通过Real-time PCR法得到PD-L1在mRNA水平相对低、中、高表达的A549、PC-9、H1975细胞系,之后用流式细胞仪再次验证了 PD-L1在蛋白水平的表达情况以及所使用的抗体的特异性。将上述细胞系加入健康人血液上Cellsearch检测后,检测到这三株细胞系中的大部分细胞在不同的程度表达PD-L1。采集的20例NSCLC病人标本中,有10例检测到CTC,阳性检测率为50%,CTC的计数范围是1-15。在CTC检测阳性的病人中,CTC中PD-L1表达阳性的病人有6例,CTC中PD-L1阳性率波动在0%-100%,计数范围波动在0-8。统计分析结果显示肺癌病人性别、年龄、临床分期、组织学分型、吸烟与否、病理分级等临床特征与是否检测到CTC以及CTC中是否有PD-L1没有显著性关系。结论本研究首次证实NSCLC患者CTC中PD-L1蛋白检测的可行性,为临床实时动态检测PD-L1提供新的检测方法,有助于临床肿瘤患者的个体化治疗。