第一部分基于PEG分级联合免疫亲和层析的外周血浆蛋白质组研究研究背景由于血浆成分复杂且蛋白浓度差异较大,血浆蛋白质组学研究难度较大,特别是基于质谱的血浆低丰度蛋白生物标志物研究面临巨大挑战。传统的单一分级方式并不能有效降低血浆的复杂程度,免疫亲和层析也只能有限的提高低丰度蛋白的检测效率。鉴于上述原因,我们通过聚乙二醇分级与免疫亲和层析整合的策略进行人血浆蛋白质组学研究,提高血浆蛋白质的检测效率。方法1.通过聚乙二醇沉淀法对血浆蛋白进行分级:依次用浓度为4%、8%、12%、16%、20%、24%和30%的聚乙二醇溶液进行血浆蛋白质分级。2.免疫亲和层析和质谱检测:将分级处理后的样品进行免疫亲和层析,并利用质谱技术对各组分中的蛋白质进行检测。3.质谱数据分析:通过质谱数据分析,评估聚乙二醇分级联合免疫亲和层析的方法有效性。结果1.通过凝胶染色对比不同浓度聚乙二醇分级效果,发现聚乙二醇浓度为4%时主要包含纤维蛋白原组分,浓度为12%时主要包含免疫球蛋白G组分,浓度为30%时主要包含白蛋白组分。2.聚乙二醇分级有效地将不同理化性质的蛋白质进行了分离,BF组分蛋白质分子量相对较高(>45k Da),等电点范围为5-8,CF组分等电点范围4-7。3.通过质谱分析和数据对比,发现聚乙二醇分级联合免疫亲和层析能够提高血浆蛋白质的检测效率(约43%),低丰度蛋白质的检测效率提高约(65.8%)。结论聚乙二醇分级处理联合免疫亲和层析的血浆样品处理策略可以降低血浆蛋白质的复杂程度,提高血浆蛋白质组学的鉴定效率。第二部分基于快速交联和两步沉淀法的血清白蛋白组分析研究背景在血浆蛋白质组学研究中,我们通常会首先去除血清白蛋白等高丰度蛋白质,然而在此过程中与血清白蛋白相互作用的蛋白和肽段也会被去除。这些蛋白和肽段共同组成白蛋白组,且具有重要的病理生理作用,是潜在的疾病生物标志物。亲和吸附和化学沉淀的方法都曾被应用于富集白蛋白组,但是这些方法还有待继续改进。本研究中我们利用快速交联及聚乙二醇和乙醇两步沉淀法富集白蛋白组,以发现更多的有价值的低丰度蛋白质。方法1.甲醛交联,固定相互作用蛋白质:通过对不同浓度和不同交联时间的血清蛋白进行凝胶染色分析,确定甲醛交联的最佳浓度和交联时间。2.聚乙二醇沉淀联合乙醇沉淀富集血清白蛋白:利用凝胶染色分析和免疫印迹分析确定富集血清白蛋白的聚乙二醇和乙醇最适浓度。3.质谱结果生物信息学分析:与前期研究结果进行对比,并构建白蛋白相互作用网络。结果1.通过对比确定最佳的血清交联条件为:甲醛浓度10%,交联时间5秒。2.浓度为12%的聚乙二醇溶液可以有效去除免疫球蛋白G对后续实验的影响。乙醇浓度为57%(PEG4000)和60%(PEG6000)时血清白蛋白的富集效果最好。3.质谱分析共鉴定到171个蛋白质,其中125个蛋白质参与构建白蛋白相互作用网络,直接作用蛋白质21个,间接作用蛋白质104个。质谱结果中有低丰度蛋白质28个,其中12个为首次发现的白蛋白相关蛋白质。结论基于快速交联的聚乙二醇和乙醇两步沉淀法可以有效富集血清白蛋白组,白蛋白组的质谱分析发现新的具有临床诊断价值的低丰度蛋白质。第三部分大鼠中枢脑区杏仁核蛋白质组及其在慢性温和应激下的变化研究背景杏仁核作为中枢神经边缘系统的一部分,可以产生、识别和调节情绪,被称作“情绪脑”,在人类学习、记忆和情感等方面起重要作用,与多种神经精神疾病紧密关联。然而,目前此类疾病(如抑郁症)相关的蛋白质组学研究大多聚焦于海马和前额叶皮层等脑区,而杏仁核研究相对较少。作为抑郁情绪活动调控脑区,杏仁核形态和功能变化与海马和前额叶差异较大,其相关分子调控机制尚需探讨。方法1.构建动物模型,并进行行为学评估:进行为期8周的慢性温和刺激造模,通过糖水偏好实验和强迫游泳实验等行为学检测,得到对照、应激敏感和应激抵抗组。2.定量蛋白质组学分析:采用基于稳定同位素标记的相对和绝对定量(i TRAQ)蛋白组学技术对各组杏仁核的蛋白质表达水平变化进行高通量质谱检测,数据库检索后进行生物信息学分析。3.免疫印迹检测和细胞模型构建:选取感兴趣蛋白进行免疫印迹分析,并构建细胞模型以探讨潜在的分子调控机制。结果1.糖水偏好实验结果提示应激敏感组大鼠糖水偏好程度明显低于对照组和应激抵抗组大鼠,强迫游泳实验结果提示应激敏感组大鼠的不动时间明显长于对照组和应激抵抗组大鼠。2.质谱检测共定量蛋白质2562个,其中102个蛋白质表达存在组间差异。定位和功能分析发现25个(25%)突触相关蛋白质。3.免疫印迹分析:结果显示NMDA和AMPA受体发生了显著性变化,表明杏仁核中谷氨酸能传递受到CMS影响;调节谷氨酸能信号的PSD-95和Ca MKIIβ的表达水平在应激敏感组中呈现增加。此外,涉及谷氨酸摄取的VGlu T1在两个应激组中也显著增加。这些调节和协作分子的变化为应激敏感大鼠杏仁核异常的突触形态和功能可塑性分子机制提供了重要信息。结论该研究所发现的CMS敏感性相关因子(包括Glu N2A/B,PSD-95和Ca MKIIβ)可能为潜在的抗抑郁靶标;慢性温和应激下的杏仁核蛋白质特别是突触蛋白变化将有助于增进我们对抑郁症杏仁核突触可塑性的理解。