缺血性心脏病(ischemic heart disease, IHD)患者经药物、介入、搭桥治疗后,患者的病死率和致残率可明显降低,然而,临床上仍有5%-10%的部分患者不宜选择上述治疗方法,探索新的治疗方法和途径对此类患者显得尤为重要。随着心血管疾病发病机制分子水平研究的深入,“治疗性血管生成(therapeutic angiogenesis)"基因疗法已成为IHD治疗的新策略。血管新生作为一个新的治疗措施可以增加缺血心肌的血流灌注,成了IHD治疗研究的热点。在基因疗法的研究中,安全有效的基因运送载体是临床基因治疗成功的保证。近年来,随着超声造影技术的不断改进及可携带基因超声微泡造影剂研制的进展,使得超声已经从一种单纯的临床诊断工具发展成为一种有潜力的治疗方法。超声靶向微泡破坏(Ultrasound-targeted microbubble destruction, UTMD)通过在特定部位发射不同声强的超声波,致该部位微泡发生破裂,产生空化,使得血管内皮屏障损伤,血管通透性增加,从而使外源物质通过本来无法通过的血管内皮屏障到达特定的部位。UTMD转运系统中如何将超声微泡改造成基因携带量大、稳定的载基因微泡是值得关注的问题。本研究制备阳离子脂质微泡(Cationic liposomes microbubble, CLM),旨在为UTMD非病毒基因转运系统提供有效的载体；运用UTMD联合RNA干扰技术,将CLM/基因复合物转运至缺氧细胞模型,观察治疗性血管生成因子表达。建立大鼠IHD模型,探讨UTMD联合CLM介导shRNA转染促进缺血心肌血管新生的作用,观察其对心功能改善情况,以期为IHD的基因治疗提供一种安全、有效的方法。目的①制备阳离子脂质超声微泡(CLM),评价其理化性质及毒性反应；②探讨超声联合CLM介导绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染的增强作用。方法①阳离子脂质微泡的制备及质量研究：采用薄膜水化法制备CLM,分别于1h、24h、3d、7d、14d光镜及电镜下观察其形态,纳米激光粒度测量其粒径及电位,检测其稳定性；急性细胞毒性实验和急性动物毒性实验观察其毒性；②探讨不同转染方式对绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染的增强作用。实验分组：裸质粒组(P组)、超声辐照+裸质粒(P-US组)、裸质粒+超声微泡(P-CLM组)、裸质粒+超声微泡+超声辐照(UTMD组)。荧光显微镜观察EGFP的表达情况,流式对EGFP表达行定量分析。结果①光镜及电镜下观察,CLM呈球形,大小一致,分布度好；CLM均为纳米级,粒径范围分布于(250.4±88.32)nin-(399-±99.8)nm；电位分布于(18.8±4.97)mV-(20.1±3.1)mV；体内、外急性毒性实验均示无毒性。②荧光显微镜观察,各组于转染48h后均可见EGFP表达。UTMD组EGFP表达分布最多,亮度最强,P-CLM组次之,以P组最弱；流式细胞仪定量分析结果与荧光显微镜观察结果一致。与P组比较,P-US、P-CLM及UTMD组转染率增加；P-US组比较,P-CLM和UTMD组转染率效率均增加；与P-CML组比较,UTMD组转染效率明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。P-US转染效率较P组增加近6倍；P-CLM组较P组增加约10倍；UTMD组较P组增加近30倍。结论采用薄膜水化法成功制备表面带正电荷纳米级CLM,粒径分布均匀,无毒副作用；超声联合CLM可显增EGFP转染至靶细胞。目的构建靶向PHD2基因的shRNA真核表达载体,采用超声靶向微泡破坏(UTMD)联合RNA干扰技术,探讨PHD2-shRNA转染缺氧诱导条件下人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的可行性,研究PHD2-shRNA对PHD2基因的沉默效应,进而促进HIF-1α及其下游促血管生成因子表达。方法构建靶向PHD2基因的shRNA真核表达质粒(shPHD2)和对照质粒(shScramble),将缺氧反应元件(HRE)寡核苷酸片段插入至shPHD2以及shScramble质粒；通过UTMD介导shPHD2和shScramble转染至HUVEC细胞；体外模拟HUVEC缺氧微环境；观察常氧及低氧状态下shPHD2转染效率。RT-PCR、Western blots检测常氧和缺氧状态下PHD2、HIF-1α及其下游促血管生成因子的表达。结果测序分析证实重组质粒构建成功；荧光显微镜观察常氧及低氧环境下,HUVEC细胞内均可见红色荧光表达；荧光素酶活性检测进一步证实,与对照组比较,常氧及低氧环境下,shPHD2转染组荧光素酶活性增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。细胞置于低氧环境后,血管生成因子表达增加。Western blot结果证实低氧shPHD2转染组HIF-1a表达呈稳定增加。为了验证HIF-1a表达增加是由shRNA沉默PHD2基因所致,RT-PCR检测结果进一步证实shPHD2转染后,PHD2mRNA表达减低的同时,伴HIF-1a及其下游3个与血管生成因子均表达增加,与对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。因此,低氧状态及常氧状态沉默PHD2基因均能增强HIF-1a表达水平,诱导HIF1a下游促血管生成因子表达。结论UTMD介导PHD2干扰质粒能有效沉默PHD2基因,促进HIF-1α及其下游促血管生成相关因子的表达。目的探讨超声靶向微泡破坏(UTMD)介导PHD2-shRNA转染治疗大鼠急性心肌梗塞(MI)的治疗效果。方法左冠状动脉结扎法建立大鼠急性MI动物模型,随机分为：假手术组(sham组,n=30)；MI对照组(shScramble组,n=60)：注射shScramble对照质粒；治疗组(shPHD2组,n=60)：注射PHD2-shRNA干扰质粒。分别于术前、术后第1d、7d、14d、28d行超声心动图检查；处死动物,对组织样本行Masson’s trichome及H&E染色后行组织学检查；RT-PCR检测PHD2、HIF1a、VEGF、TGFβ、bFGF在各组标本中mRNA表达情况；采用免疫组化SABC法检测心肌梗死区域PHD2和HIFa及CD34的表达。结果①shPHD2组较shScramble组心功能明显改善；与shScramble组比较,shPHD2组第7d、14d及28d所测LVEF、LVFS值均增加,差异均有统计学意义(P＜0.05)。②与shScramble组比较,shPHD2组治疗后CVF和PVCA均显著减少,差异有统计学意义(P<0.05)。③RT-PCR检测shPHD2组与对照组比较表达减低,而HIF-1αmRNA及其下游促血管生成因子VEGF、TGFβ、bFGF mRNA表达增加,于第14d时达高峰,差异均有统计学意义(P＜0.05)。④免疫组织化学结果显示,shPHD2组内HIF-1α、VEGF均较shSchamble组表达增加,于第14d达峰值,差异均有统计学意义。与shSchamble组比较,shPHD2组内可见更多新生血管形成,二组间比较,差异有统计学意义。结论UTMD可促进PHD2-shRNA转染至大鼠心肌组织；靶向PHD2基因的shRNA干扰质粒可有效促血管生成因子表达；UTMD联合CLM介导PHD2-shRNA转染可促进缺血心肌内新生血管形成,有效改善大鼠心功能。