实验目的：　　为了改善角膜供体严重缺乏的现状，本研究希望通过组织工程的方法寻找一种生物材料来作为角膜替代材料，用于局灶性损伤角膜的结构修复和视力恢复。明胶是一种天然生物材料，具有良好的生物相容性，分别通过丙烯酸酸酐和半胱胺进行改性，使其具有光固化的特性。将水凝胶前驱体填补局灶性角膜缺损处，再用特定波长的紫外光辐射固化，从而原位修复受损角膜。　　实验方法：　　明胶（GE）与丙烯酸酸酐（AA）反应生成GE-AA，GE与半胱胺反应生成GE-SH，对产物GE-AA和GE-SH进行核磁共振氢谱（1H NMR）分析，判断接枝成功与否，并分别计算接枝率。通过改变 GE-AA/GE-SH的比例、紫外光强度与前驱体固含量来合成不同性能的水凝胶，再对合成的水凝胶进行流变学分析、扫描电子显微镜（SEM）分析、透光率测定、溶胀率测定和体外降解性能测定，来分析不同条件下合成的水凝胶的不同理化性质。通过 CCK-8体外细胞毒性实验、死活细胞染色实验以及细胞追踪实验，来研究该水凝胶的体外生物相容性。通过3mm角膜环钻移除新西兰白兔角膜特定区域的上皮和基质来构建角膜局灶性缺损模型，将灭菌处理后的水凝胶前驱体填补缺损组织并用365nm紫外光进行原位固化。通过裂隙灯观察眼前节炎症反应和角膜修复情况；通过角膜光学相干断层扫描（OCT）来观察角膜预后及眼底状况，评估该水凝胶是否有助于促进角膜损伤修复及该植入方法是否对眼底有损害；通过角膜内皮镜检查来观察紫外光辐射对角膜内皮细胞数量和形态的影响，从而评估该水凝胶及其植入方法是否对角膜内皮细胞有损害。通过水凝胶合成、理化性能分析、体外生物相容性实验与动物体内角膜修复实验这一系统的实验研究，对GE-AA/GE-SH水凝胶是否有助于局灶性角膜损伤修复作出结论。　　实验结果：　　AA与GE在PH值为7.4～8.0的条件下可反应生成GE-AA；半胱胺与GE在PH值为4.0～6.0的条件下，在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）催化下，反应生成GE-SH。通过改变GE-AA/GE-SH的比例、紫外光强度与前驱体固含量可以获得不同机械性能的水凝胶，同时通过固含量的改变还能够调整水凝胶的微观结构、透光性能、溶胀性能和降解性能，其中固含量是对水凝胶理化性能影响最大的因素。通过表征实验，我们确定GE-AA/GE-SH水凝胶是一种高分子网络结构，表面和内部遍布直径100～200μm的孔道，允许水和营养物质透过，有利于为活细胞的生命活动提供物质基础；该水凝胶透光率大于90％，将其作为角膜损伤修复材料应用于眼表对角膜的透光性影响小；良好的溶胀性能使其具有很高的吸水性，有利于触感的柔软舒适和氧透过率的提高；良好的降解性能有利于角膜自身组织生长和替代水凝胶材料，最终达到角膜组织再生的目的。体外生物相容性实验是评价该水凝胶对 L929小鼠成纤维细胞的影响。CCK-8体外细胞毒性实验显示，L929细胞能在该水凝胶表面粘附生长、分裂增殖，在7d内无毒性反应与异常表现；死活细胞染色和细胞追踪实验表明，L929细胞被包载入该水凝胶、接受365nm波长、100 mW/cm2光强紫外辐射2min后，7d内大部分L929细胞仍然能够在水凝胶支架内迁移、增殖、生长，保持活力。最后将该水凝胶原位填补角膜缺损，裂隙灯观察结果表明该水凝胶能够促进角膜上皮的生长、角膜组织的修复；OCT检查显示该水凝胶能在一定程度上减少瘢痕的形成，对眼底组织无显著影响；角膜内皮镜检查表明紫外光辐射对角膜内皮无明显影响，动物眼压基本保持稳定。　　实验结论：　　GE-AA/GE-SH可注射光固化水凝胶可以通过改变GE-AA/GE-SH的比例、紫外光强度和前驱体固含量，对其理化性能、降解性能进行调控。该水凝胶具有良好的生物相容性，对角膜损伤具有促进修复和减少瘢痕的作用，有希望成为新一代局灶性角膜损伤修复和再生生物材料。