Sombati癫痫样放电模型中神经元丢失及Caspase3表达的研究 癫痫是神经内、外科的常见病，超过1％的成人、2％的儿童患有癫痫。颞叶癫痫是癫痫中的常见类型，约占癫痫总数的20-30％，其中部分患者采用药物治疗无法控制，成为难治性癫痫，社会危害较大。 一般认为颞叶癫痫的发病与海马神经元丢失死亡有关，但海马神经元丢失的具体方式和详尽的机制还不清楚。1995年Sombati首次通过将原代培养的海马神经元经短暂无镁培养后制备出海马神经元反复自发性癫痫样放电的细胞模型，该模型与临床颞叶癫痫较为贴近。Sombati发现模型中海马神经元反复癫痫样放电后也出现神经元丢失死亡的现象，但神经元以何种方式死亡未作进一步研究。本实验研究了Sombati模型中神经元反复自发性癫痫样放电后神经元丢失的方式及其Caspase3的表达情况，为探讨癫痫病人海马硬化的机理提供线索。本研究分两部分内容。一、Sombati神经元癫痫样放电模型中神经元的丢失 本实验首先取新生SD大鼠海马神经元培养，依据Sombati法制备神经元自发性癫痫样放电模型，并采用膜片钳全细胞记录技术予以确认；然后以DNA梯度电泳、Tunel标记和荧光染色对模型中是否存在神经元凋亡现象作初步定性观察；最后采用流式细胞仪细胞技术对各时间段神经元丢失死亡情况作定量检测。实验结果发现经无镁培养3 二小时处理后，神经元出现阵发性的连续动作电位，放电频率 41 6Hi，同时出现阵发性去极化移位。模型组无镁处理12小时后可见明显的形态改变，部分细胞细胞体边缘呈弧形，神经突起菲薄或呈串珠状；部分细胞失去正常的细胞形态，呈球形。Tunel标记显示模型组和正常培养标本内散在分布有染色阳性细胞，阳性染色呈肾形或类球形，紫红色。阳性标记的细胞均失去正常的细胞形态，外观形态正常的神经元未见有阳性染色。荧光染色发现在正常培养标本和模型组均观察到三种类型染色阳性细胞，一类为单纯PI染色，呈红色，此为坏死神经元；一类为单纯Annexin－V染色，呈蓝色，此为早期凋亡细胞或凋亡小体；一类兼有PI和Ann6kin－V染色，这是晚期凋亡神经元或坏死细胞。正常培养标本及模型组电泳均呈现梯度条带，条带大小为 180－200hP整数倍。流式细胞仪检测发现在模型组在无镁处理后3小时内，死亡细胞百分比较正常培养标本增加，随后两组问坏死细胞数相近；同时模型组在无镁处理6小时后凋亡细胞较正常培养组开始明显增加，单位时间内凋亡细胞数较多。 实验结果说明在Sombati神经元癫痫样放电后神经元是以两种方式丢失死亡，早期由于细胞能量的大量消耗，神经元主要以坏死形式死亡，而后期的延迟性神经元丢失主要以凋亡方式死亡。＝、Caspase3 cDNA的克隆及在 Sombati模型中的表达 细胞的凋亡是细胞的主动自杀。细胞被凋亡激发因子激发后，启动凋亡程序。目前认为凋亡过程可分为：启始门N成tnn）、传播（Propagation）、执行（Commitment）和处死（Execmion）共 4个阶段，各阶段由相应的凋亡相关基因调控。Caspase上是Caspases家族的核心成员，参与了众多类型组织细胞凋亡的下游调控。本实验亦拟观 3察神经元癫痈样放电后C朋p朋 的表达情况，以初步探讨癫瘸样放电致神经元丢失凋亡的分子调控机制，为干涉、控制神经元的凋亡提供基础。本实验首先采用 RTPCR法克隆全长 Caspase3 cDNA，然后采用原位杂交法观察Sombati模型中Caspase3基因表达情况，最后利用流式细胞技术对神经元癫痈样放电后Caspase3蛋白的表达情况作定量检测。结果本实验克隆到全长的 Caspase3 cDNA，测序结果表明阅读框架正确。原位杂交显示正常培养标本神经元仅少数细胞弱阳性染色，模型组染色阳性细胞较多，尤其是无镁处理12小时后，有较多强阳性染色神经元。流式细胞仪检测显示正常培养标本有 10％l％的神经元Caspase3表达阳性，模型组在无镁处理6 ／J’时后Caspase3表达量较正常培养标本增高。模型组Caspase3表达与神经元凋亡有显著相关性（P＜o刀1）。实验结果提示癫瘸样放电后神经元的凋亡可能由C。sp。sc3所介导。 综上所述，本研究共获得如下结果：l、观察到Sombati模型神经元癫痈样放电后，神经元的丢失包括早期的坏死和延迟性神经元凋亡。2、本实验克隆到的全长 Caspase3 cDNA，为进一步深入研究神经元凋亡的分子机制提供了条件和实验基础。3、实验发现神经元反复自发性癫痫样放电后C。Sp朗 表达细胞数增加，且与神经元凋亡有显著的统计学相关性，提示癫瘸样放电后神经元的凋亡可能由Caspase3所介导。