论文部分内容阅读
目的 研究环氧化酶—2（cyclooxygenase—2，COX-2）选择性抑制剂Celecoxib通过细胞内信号传导通路蛋白激酶B（PKB／AKT）对人骨肉瘤细胞MG-63凋亡的影响，探讨Celecoxib诱导人骨肉瘤细胞MG-63凋亡和抑制肿瘤血管形成的机制。 方法 MTT比色和流式细胞仪观察Celecoxib诱导人骨肉瘤细胞MG-63凋亡的量效关系和时效关系；Hoechst 33258荧光染色、透射电子显微镜和TUNEL观察细胞凋亡的形态学变化；用poly-HEMA制备细胞悬浮培养条件，通过DNA Ladder、软琼脂集落形成实验以及AnnexinV-FITC／PI双标染色检测MG-63细胞抗失巢凋亡的特性；流式细胞仪检测Celecoxib诱导MG-63细胞失巢凋亡时细胞周期的变化；逆转录聚合酶反应（RT-PCR）和Western Blot研究PKB／AKT信号通路中与凋亡相关的分子AKT、磷酸化AKT、Bad、磷酸化Bad、mTOR及其下游底物4EBP1 mRNA和蛋白水平表达；采用皮下注射法建立人骨肉瘤裸鼠移植模型，免疫组织化学技术观察Celecoxib对荷瘤裸鼠体内微血管密度的作用；RT—PCR和Western Blot检测Celecoxib对荷瘤裸鼠瘤体COX-2和VEGFmRNA和蛋白表达的影响。 结果 分别以终浓度0.1、1、10、50、100μmol／l Celecoxib作用MG-63细胞后，凋亡率随浓度增加而增加，各组细胞凋亡的程度差异显著（P＜0.05或P＜0.01）；50μmol／l Celecoxib作用MG-63细胞，随作用时间延长凋亡率逐步升高，24h、48h、72h后的细胞凋亡率存在显著差异（P＜0.05或P＜0.01）；荧光显微镜、透射电镜和TUNEL观察到细胞胞质浓缩、核深染、核凝聚、核碎裂和凋亡小体形成等典型的凋亡形态学变化；DNA Ladder发现悬浮培养的MG-63细胞没有出现细胞凋亡中典型的Ladder，而软琼脂集落形成实验观察到MG-63细胞能在琼脂培养基中形成逐渐增大的集落；AnnexinV-FITC／PI双标染色显示悬浮培养MG-63细胞凋亡率较低，与对照组间存在明显差异（P＜0.01）；流式细胞仪观察到Celecoxib可以使悬浮培养MG-63细胞周期发生G0／G1期阻滞；RT-PCR和Western Blot发现Celecoxib能够有效下调细胞内磷酸化AKT、磷酸化Bad的表达，从而促进caspase9和细胞色素C表达，随作用时间增加作用效果更加明显（P＜0.05或P＜0.01）；在悬浮培养的细胞中，Celecoxib能够调节mTOR和4EBP1的表达，随作用时间的不同，表达水平差异显著（P＜0.05或P＜0.01）；免疫组织化学技术发现Celecoxib能影响荷瘤裸鼠体内瘤体MVD的形成，；RT-PCR和Western Blot显示Celecoxib抑制荷瘤裸鼠瘤体COX-2和VEGF mRNA及蛋白水平的表达，与对照组比较差异显著（P＜0.05）。 结论 Celecoxib以剂量依赖和时间依赖方式诱导MG-63细胞凋亡；Celecoxib启动细胞凋亡的程序可能主要通过调节PKB／AKT信号通路中AKT和Bad磷酸化水平及下游底物细胞色素C、caspase9的表达来实现；MG—63细胞存在抗失巢凋亡的生物学特性，而Celecoxib通过调控AKT磷酸化水平及其下游底物mTOR和4EBP1的表达诱导细胞发生失巢凋亡；Celecoxib能够抑制荷瘤裸鼠瘤体MVD的形成，其作用途径可能主要与抑制COX-2和VEGF的表达有关。