芸薹属(Brassica)包括 100 多个种,其中许多是重要农作物。多年来对芸薹属农作物的研究,取得了巨大成就,特别是在改良种质、改善品质、提高产量等方面的工作,为芸薹属作物的生产发展贡献极大。然而,传统的方法越来越受到自然条件的限制,主要表现在种内基因资源不足,种间基因资源配置障碍多等方面。生物技术的兴起,为克服这些困难,实现种质资源的合理配置,提供了新的途径。通过基因工程的方法,转移重要基因,已经获得成功。目前,应用于芸薹属作物基因工程的方法,主要是由农杆菌介导的叶盘转化法。这种方法在其它作物上获得了成功的应用,但也发现了许多问题,特别是由细胞变异引起的畸形、发育障碍、基因型依赖性等问题,为其增加了许多困难,这些问题主要是由于外植体的离体培养再生所引起,在芸薹属作物上表现更为突出,特别是白菜类作物,至今无法获得稳定常规的转化方法。采用不需要组培技术的原位转基因方法,对芸薹属作物的基因改良,将有着较好的推动作用。原位转化法包括种子转化法、浸花法、伤口接种法、真空渗入法等一类方法,在拟南芥上获得较好的效果,但在重要经济作物上的应用研究还未有重要进展。本研究利用真空渗入法,进行白菜转基因试验,成功地取得了转化株。1 真空渗入法获得转基因抗虫菜心。 1<WP=11>利用真空渗入法获得转基因抗虫白菜及其转化机理的研究 本研究首先以小白菜类的菜心为试材,利用农杆菌 C58 株系,通过真空渗入法,将含有马铃薯蛋白酶抑制剂基因(pinⅡ)、蜘蛛杀虫肽基因(sip)和筛选基因(bar)的 T-DNA转入到菜心中去。通过除草剂筛选,获得了抗性植株,通过分子检测证明,外源基因已经完全整合到了菜心的基因组中。对 PINⅡ蛋白质的测量表明,pinⅡ基因得到了有效的表达,PINⅡ蛋白对牛胰蛋白酶的活性,具有较强的抑制作用,统计分析表明,抗性株与非转基因株之间,存在极显著的差异。抗虫试验表明,小菜蛾的幼虫期、蛹重量、蛹获得率,成虫获得率,不同的转基因株系之间,具有显著差异,拥有相同有效插入片断的株系,其抗虫效果也不相同,表明各个转基因株系之间,外源基因的表达具有极大复杂性和差异性,并从转基因株系后代中,筛选到较好的抗虫转基因株系。2 抗性基因的遗传与表达 真空渗入法转化菜心的结果显示,转化率较低,基本稳定在 0.01%左右。转化株频数与其亲本的种子量不呈直线关系,从数据分布图看,接近正态分布,这个结果表明了转化事件的有条件性。被转化的种子多数分布在花序的上部,这说明农杆菌的转化目标可能是处于早期生长发育阶段的花蕾。这个结果与下面的测交结果相吻合。 真空渗入法获得的转基因植株,采用测交的方法证明,测交后代的分离比是 1∶1,这表明 T1 代是杂合体,杂合体的结果说明,转化事件发生在 T0 代植株授粉之前的胚珠或者花粉,而不是雌雄蕊分化之前的分生组织。3 真空渗入法获得抗虫大白菜及遗传分析 大白菜是芸薹属中最难转化的作物,不仅离体再生体系难建立,而且对农杆菌的侵染过于敏感,容易导致外植体死亡。本研究采用真空渗入法成功地获得了抗性植株,Southern 检测证明,外源基因整合到白菜的基因组中,呈现 2 个插入片断;RT-PCR 表明,外源基因能够顺利转录出 mRNA;对 PINⅡ蛋白的测定表明,mRNA 能够被准确剪接,翻译成蛋白,并对牛胰蛋白酶表现出抑制作用,统计分析表明与非转基因株对照差异极显著。大白菜的 T1 代转化株呈现为杂合体,自交后代呈现 3∶1、2∶1、1∶1 的分离比例,以转化株为花粉受体的测交后代分离比呈现 1∶1,以转化株为花粉供体的测交后代分离比为 7∶9,也表明了花粉传递能力的不足。 真空渗入法转化的白菜,其自交后代株系的抗性分离,与叶盘转化法的结果相似,也是以单基因有效插入片断居多,分离比 3∶1 的株系,占比例最大,其它情况出现 15∶1、63∶1、2∶1、1∶1 等比例,许多分离比处于中间型,表明外源基因的外显率降低;值得注意的是 1∶1 分离比的株系,极有可能是由于配子体的传递问题而引发的,这种 2<WP=12>山东农业大学博士学位论文现象说明外源基因在配子的传递过程中,出现损失。测交结果显示,以转化株为花粉受体的组合,能够产生正常的 1∶1 的预期分离结果,以转化株为花粉供体的杂交组合,其后代出现非 1∶1 的分离结果,其中敏感株比例增多,抗性株比例减少,这个结果表明花粉更容易丧失传递外源基因的能力。4 真空渗入法转化白菜的机理 真空渗入法转化白菜的转化率还不高。进一步研究表明,菜心花蕾的结构可能构成重要障碍,菜心的花发育速度与拟南芥有着较大的不同,菜心的子房生长发育较快,在雌蕊发生初期,子房同拟南芥的子房一样呈开口杯状,但很快就生长出柱头组织,封闭了子房的开口,这个事件大约出现在花蕾开放的 10 天以前。 本研究还构建了 pBBB-GUS-Intron 载体,该载体含有 bar 基因,有利于后代的筛选;所含的 GUS-intron 基因完全满足组织化学定位试验的要求。利用这个载体,进行了真空渗入法转化菜心的组织化学定位,结果发现,农杆菌优先转化雌蕊的胚珠,也发现了转化的萼片,但没有发现在?