【摘 要】
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该研究主要探讨人TPO基因牛体细胞定点整合载体构建及其进行细胞转染的可行性.参照奶牛、绵羊、山羊等的β-酪蛋白序列设计了一对引物P1、P2,以本地水牛和内蒙古绵羊基因组
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该研究主要探讨人TPO基因牛体细胞定点整合载体构建及其进行细胞转染的可行性.参照奶牛、绵羊、山羊等的β-酪蛋白序列设计了一对引物P1、P2,以本地水牛和内蒙古绵羊基因组为模板,采用高保真Ex Taq酶,扩增得到水牛、绵羊β-酪蛋白基因的5′调控区序列(分别长4.5Kb、4.1Kb).将扩增产物克隆到pMD-18T上,经酶切分析、部分序列测定和同源比较确认得到了所需的基因片段.测序结果与水牛和绵羊的相应序列同源性分别达到98％(833bp)、98%(735bp).利用已克隆的TPO基因(5.5Kb)、奶牛as1-酪蛋白基因同源臂序列(6.0Kb和1.78Kb)、水牛和绵羊β-酪蛋白5′调控区序列和ploxp质粒骨架,经多步酶切-连接-转化-筛选-鉴定基因重组过程(连接片段不经过脱磷酸化处理),最终建成两个人TPO基因牛体细胞打靶载体:ploxp-6.0-BβCN-TPO-1.78和ploxp-6.0-SβCN-TPO-1.78,长达25Kb.采用PCR和酶切分析对构建载体进行全面验证,确认得到了设计的打靶载体.采用脂质体法,将线性化的打靶载体ploxp-6.0-SβCN-TPO-1.78导入体外培养到第3代的奶牛成纤维细胞,采用G418+GANC进行筛选,筛选到第24天时,得到抗性细胞.结果表明:(1)应用LA-PCR技术,采用高保真Ex Taq酶能扩增得到绵羊和水牛beta-casein基因的5′调控区序列.(2)绵羊、水牛β-酪蛋白基因的5′调控区(启动子)、人血小板生成素(TPO)基因(目的基因),靶向奶牛as1-酪蛋白基因的长、短同源臂(靶向基因)等基因元件不经脱磷酸化处理也可成功连接到ploxp质粒载体骨架上,构建成两个长25Kb的人TPO基因牛体细胞定点打靶载体.(3)构建得到的人TPO基因牛体细胞定点打靶载体线性化后用脂质体法进行细胞转染,长期筛选后能得到抗性细胞.
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