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实验背景:
子痫前期(preeclampsia)是最常见的妊娠期并发症之一,是孕产妇和围生儿病率及死亡率的主要原因,严重影响母婴健康。但是,到目前为止该病仍没有确切有效的治疗办法。子痫前期的病因目前还不是很清楚,比较公认的是由于“胎盘的浅着床”导致胎盘缺血缺氧,从而使巨大发生了过度炎症反应,许多炎症因子从胎盘释放到母体血液循环中,与母体的血管内皮细胞和免疫细胞发生反应,从而引起子痫前期的相关症状。
脂氧素(lipoxin,LX)被形象地称为炎症反应的“刹车信号”,通过跨细胞途径由花生四烯酸(arachidonic acid)合成,它具有抗炎和促炎症消退,但又不损伤机体的正常生理功能的独特药理作用。近年来,脂氧素在许多炎症相关疾病的治疗研究中取得了重要进展,这也为我们预防和治疗子痫前期提供了新思路和理论依据。
实验目的:
体内实验,采用子痫前期大鼠模型,研究LXA4类似物BML-111对子痫前期临床症状高血压和蛋白尿的影响,研究BML-111对子痫前期胎盘和肾脏病理改变、全身和胎盘部位炎症反应的影响。体外实验,研究LXA4对LPS刺激的人早孕期绒毛外层滋养细胞株(TEV-1)的增殖、凋亡和炎症因子产生的影响及其机制。
实验方法:
体内实验,通过向大鼠尾静脉注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)建立起子痫前期大鼠模型,腹腔注射BML-111进行治疗,用BP-98A血压仪测量大鼠血压的变化,BCA蛋白分析试剂盒检测蛋白尿改变,HE染色法观察胎盘和肾脏病理变化,ELISA和RT-PCR法分别检测血液和胎盘中炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-8(IL-8)水平的改变。体外实验,采用LPS刺激TEV-1细胞以模拟炎症微环境,用MTT法观察LXA4对TEV-1细胞增殖的影响,用Annexin V和PI双标的流式细胞检测法和Western blot法观察LXA4对TEV-1细胞凋亡的影响及其机制,用ELISA法和RT-PCR法检测LXA4对TNF-α和IL-8水平的影响,用Hoechst染色、免疫荧光法和Western blot法观察LXA4对NF-κB的激活和核转位的影响。
实验结果:
1.BML-111能缓解LPS诱导的子痫前期大鼠的临床症状
体内实验结果显示,在给妊娠第14天的孕鼠注射1μg/kg LPS后,在妊娠第16天、18天和20天收缩压明显升高并高于control组(p<0.05)。从妊娠第14天起向LPS注射过的孕鼠每天腹腔注射1 mg/kg BML-111,连续6天,在妊娠第18天和20天能明显地降低收缩压(p<0.05)。在妊娠第12天,注射LPS前,control组和LPS组孕鼠的24 h蛋白尿水平没有显著性差异,但在妊娠第19天,LPS组24 h蛋白尿水平高于control组(p<0.05)。和LPS组相比,BML-111能降低妊娠第19天子痫前期大鼠的24 h蛋白尿水平(p<0.05)。
2.BML-111能减轻LPS诱导的子痫前期大鼠的胎盘和肾脏的病理损伤
LPS造成的胎盘和肾脏的病理损伤表现为胎盘毛细血管壁增厚,和肾小球硬化并伴有炎症细胞聚集。上述病理损伤能有效地被BML-111缓解。
3.BML-111能抑制LPS诱导的子痫前期大鼠体内TNF-α和IL-8的产生ELISA结果表明,相比于control组,妊娠第20天LPS组大鼠血清中的TNF-α和IL-8水平明显升高(p<0.05),用BML-111连续治疗6天能降低子痫前期大鼠血清中TNF-α和IL-8的水平(p<0.05)。同时,RT-PCR结果显示妊娠第20天LPS组胎盘中TNF-α和IL-8基因表达明显强于control组,相比于LPS组,LPS+BML-111组两者基因表达减弱。
4.LXA4促进LPS刺激的TEV-1细胞增殖
用不同浓度的LPS刺激TEV-1细胞24 h后,细胞存活率以浓度依赖的方式下降。LXA4以浓度依赖的方式增加LPS刺激的TEV-1细胞存活率,当LXA4浓度为200 nM时,细胞的存活率达到高峰。
5.LXA4抑制LPS刺激的TEV-1细胞凋亡
用1μg/ml的LPS刺激TEV-1细胞24h后,LPS组细胞的凋亡率升高到19.1±2.9%,明显高于control组的4.6±1.0%(p<0.05)。用200nM浓度的LXA4预处理LPS刺激的细胞后,能将凋亡率降至8.9±1.6%(p<0.05,和LPS组相比较)。结果还显示,LXA4的这种抑制凋亡作用会部分地被10μM浓度的LXA4受体阻断剂Boc-2阻断。Western blot结果显示,Bcl-2和Bax蛋白在control组细胞中都有表达,和control组相比,LPS能下调Bcl-2蛋白水平,上调Bax蛋白水平,LXA4能抑制LPS对这两种蛋白表达的调节作用,同时,Boc-2能部分阻断LXA4的作用。
6.LXA4抑制LPS刺激的TEV-1细胞产生TNF-α和IL-8
RT-PCR结果显示,用1μg/ml LPS刺激TEV-1细胞24h导致TNF-α和IL-8mRNA表达明显增强(p<0.05,和control组相比较),而用200nM浓度的LXA4预处理LPS刺激的细胞后能减弱两者的表达(p<0.05,和LPS组相比较)。同时,10μM Boc-2能部分阻断LXA4的作用(p<0.05,和LPS+LXA4组相比较)。ELISA实验显示,LPS刺激后导致细胞上清液中TNF-α和IL-8水平升高(p<0.05,和control组相比较),而用LXA4预处理LPS刺激的细胞后能明显降低这两种炎症因子的水平(p<0.05,和LPS组相比较),Boc-2能部分阻断LXA4的作用(p<0.05,和LPS+LXA4组相比较)。
7.LXA4抑制LPS刺激的TEV-1细胞NF-κB激活和核转位
免疫荧光实验显示,NF-κB p65主要存在于control组细胞的胞浆内,用LPS刺激细胞24h后,NF-κB p65大部分转位到细胞核内。如果先用LXA4预处理LPS刺激的TEV-1细胞,这种核转位现象就会被明显抑制,而Boc-2能部分阻断LXA4的作用。Western blot实验显示,LPS刺激会导致胞核NF-κB p65蛋白表达增强,同时减弱胞浆NF-κB p65和IκB-α蛋白表达,而用LXA4预处理LPS刺激的TEV-1细胞后就能抑制LPS的这些作用。
实验结论:
1.BML-111能降低子痫前期大鼠的收缩压和蛋白尿,减轻胎盘和肾脏的病理损伤,抑制胎盘和血液中TNF-α和IL-8的产生。
2.LXA4通过抑制LPS刺激的TEV-1细胞NF-κB的激活和核转位,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,抑制细胞产生TNF-α和IL-8。