论文部分内容阅读
【研究背景与目的】高糖(High Glucose,HG)引起海马神经元衰老与凋亡。亚精胺(Spermidine,Spd)作为一种天然的多胺,具有抗细胞衰老与凋亡的作用。神经元大麻素受体1(Cannabinoid receptor 1,CB1)具有神经保护作用。因此,在本研究中,我们将利用小鼠海马神经元HT22细胞,从细胞衰老与凋亡两个方面,探讨Spd是否可拮抗HG诱导的HT22细胞毒性并明确CB1受体是否介导Spd拮抗HG诱导的神经毒性。【方法】1.Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测HT22细胞的存活率;2.β-半乳糖苷酶(Senescence Associated acidic-β-Galactosidas,SA-β-Gal)染色法检测衰老细胞;3.台盼蓝染色计数法检测细胞生长状况;4.Hoechst 33258染色法检测HT22细胞凋亡形态;5.Annexin/PI双染流式细胞仪检测HT22细胞凋亡率;6.多功能微孔板检测系统检测HT22细胞内Caspase-3的活性;7.蛋白免疫印迹法(Western Blotting)检测HT22细胞中CB1受体蛋白、细胞衰老相关蛋白(P16INK4a和P21CIPl)以及细胞凋亡相关蛋白(Bax和Bcl-2)的表达。【结果】1.HG对HT22细胞衰老和凋亡的诱导作用。1.1 HG(13.5,27,40.5 mg/ml,48 h)处理HT22细胞能明显降低HT22细胞活力。1.2 HG(13.5,27,40.5 mg/ml,48 h)能显著增加HT22细胞SA-β-Gal染色阳性率、抑制HT22细胞生长并上调细胞衰老相关蛋白P16INK4a和P21CIPL的表达,表明HG可诱导HT22细胞衰老。1.3 HG(13.5,27,40.5 mg/ml,48 h)能明显诱导HT22细胞发生凋亡形态改变(如核固缩、核碎裂)、增加细胞凋亡率、上调细胞内Caspase-3的活性和促凋亡蛋白Bax的表达以及降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,表明HG可诱导HT22细胞凋亡。2.Spd对HG诱导的HT22细胞衰老和凋亡的拮抗作用。2.1 Spd(0.25,0.5,1μM)预处理30 min可浓度依赖性地抑制HG诱导的HT22细胞活力下降,表明Spd具有拮抗HG神经细胞毒性作用。2.2 Spd(0.25,1μM)预处理30 min能明显逆转HG(27mg/ml,48 h)诱导的HT22细胞SA-β-Gal染色阳性率增加、细胞生长抑制及衰老相关蛋白(P16INK4a及P21CIP1)表达增加,表明Spd可拮抗HG诱导的HT22细胞衰老。2.3 Spd(0.25,1μM)预处理30 min能明显克服HG(27 mg/ml,48 h)诱导的HT22细胞凋亡形态变化(如核固缩、核碎裂)、凋亡率增加、细胞内Caspase-3的活性及Bax蛋白表达增加、Bcl-2蛋白表达降低,表明Spd可拮抗HG诱导的HT22细胞凋亡。3.CB1对Spd拮抗HG诱导的HT22细胞衰老和凋亡的介导作用。3.1 HG(13.5,27,40.5 mg/ml,48 h)可浓度依赖性地下调HT22细胞中CB1受体蛋白表达,提示HG的神经毒性与其抑制CB1受体有关。3.2 Spd(0.25,1μM,30 min)预处理可明显逆转HG对CB1受体蛋白的下调,提示Spd抗神经细胞凋亡与衰老可能与其上调CB1受体有关。3.3 CB1抑制剂AM251(10μM,30 min)预处理能取消Spd对HG诱导HT22细胞活力下降以及细胞衰老和凋亡的拮抗作用,表明CB1受体介导了Spd对HG诱导HT22细胞衰老和凋亡的拮抗作用。【结论】1.HG可诱导HT22细胞衰老与凋亡;2.Spd可拮抗HG诱导的HT22细胞衰老与凋亡;3.CB1受体介导了Spd对HG诱导的HT22细胞衰老与凋亡的拮抗作用。