肺癌是全球目前最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率居肿瘤首位,且有逐年上升的趋势。非小细胞肺癌占肺癌总数的80-85%左右,包括腺癌、鳞癌、腺鳞癌以及大细胞癌。早期诊断是降低肺癌死亡率的重要手段,转移是影响肺癌预后的重要原因,大部分非小细胞肺癌病人诊断时已出现转移,5年生存率很低。尽管随着分子生物学技术和临床治疗水平的快速发展,肺癌的临床治疗手段尤其是分子靶向治疗有了一些进步,但我们对肺癌发病机制的认识仍然不足,目前缺乏有效的对早期诊断和判断预后的指标。因此,寻找肺癌早期诊断和预防、治疗肺癌转移的有效途径,延长患者生存期、提高生活质量,是当前肺癌研究的热点。高迁移率族蛋白B1(HMGB1)是一种系列高度保守的非组蛋白,它参与许多重要的生物学过程如转录、DNA修复、细胞分化、生长以及细胞外信号转导,还与肿瘤细胞的生殖分化和迁移、免疫调节等相关。目前的研究发现,在结直肠癌、肝癌患者中,HMGB1基因呈过度表达,且与肿瘤的侵袭深度及淋巴结转移、分期密切相关。有研究表明,慢阻肺患者血清HMGB1水平是正常人的5倍。肺癌患者血清HMGB1水平高于COPD患者以及正常人。侵袭和转移是恶性肿瘤的基本特征,细胞外基质是细胞移动的生化屏障,它的降解是肿瘤细胞转移的重要过程,此过程中,基质金属蛋白酶起到了重要作用。基质金属蛋白酶是锌依赖性蛋白酶,可以降解细胞外基质的多种成分,在多种病理生理过程中以及肿瘤的侵袭和转移中起重要作用,基质金属蛋白酶-9是参与在肿瘤细胞侵袭过程中的重要因子,因为它能降解细胞外基质明胶和Ⅳ型胶原,后者是肿瘤细胞的入侵的重要屏障。研究显示,MMP-9与非小细胞肺癌的不良预后相关。但在非小细胞肺癌中,HMGB1和MMP-9的关系尚不明确。CEA是一种分子量为180kd的血清糖蛋白,属于免疫球蛋白基因超家族成员。CEA主要在腺癌包括结肠癌、直肠癌、乳腺癌和肺癌中高表达。目前的研究显示,CEA在肺腺癌中表达增高,且手术前血清CEA水平与5年生存率相关,术后CEA水平仍增高的患者预后不良,对于晚期不能手术切除的患者,高CEA水平的患者无疾病进展期和生存期都缩短。还有的研究提示血清CEA的水平与患者对化疗药物的反应有关,化疗前后CEA的下降幅度与预后有关。我们的研究旨在从核酸、蛋白以及血清水平探讨HMGB1在肺癌的表达及意义,分析HMGB1和MMP-9在肺癌组织表达的相关性,及肺癌患者血清HMGB1和CEA的水平的相关性。第一部分非小细胞肺癌中HMGB1和MMP-9的表达以及两者的相关性分析目的：HMGB1在非小细胞肺癌中的发生、转移中起到的作用尚不明确,我们的研究旨在从核酸、蛋白水平上测定非小细胞肺癌组织中高迁移率族蛋白B1、基质金属蛋白酶-9的表达,并探讨HMGB1和MMP-9在肺癌组织的表达与肿瘤分期、临床病理类型的关系。以及分析HMGB1和MMP-9在肺癌组织表达的相关性。方法：选取30例诊断明确的新鲜肺癌组织作为荧光定量PCR (RT-PCR)、 Western blot免疫印迹法的实验组,相应癌旁正常肺组织设为配对对照组。利用RT-PCR法测定肺癌组织以及对照肺组织中HMGB1的mRNA的表达。提取RNA,以β-actin为内对照,应用qPCR仪进行检测,HMGB1的相对表达量通过CT值计算得出。Western blot法测定肺癌组织以及对照肺组织中HMGB1蛋白的表达。用免疫组化法测定100例肺癌组织和30例癌旁正常对照组织HMGB1的表达。经HE染色、镜检及图像分析,测定HMGB1在肺癌组织的表达,分析HMGB1与临床分期、病理类型的相关性。用免疫组化法测定50例肺癌组织和30例癌旁正常对照组织MMP-9的表达。Barnes法计算表达强度和阳性细胞比例,表达强度x阳性细胞比例计算得评分。HMGB1和MMP-9在肺癌的表达阳性率作相关性分析。统计分析：采用SPSS17.0进行统计学分析,以平均数±标准差表示。HMGB1在肿瘤以及正常组织中mRNA以及蛋白水平的表达采用配对样本t检验。HMGB1在肿瘤以及正常组织中的表达、不同性别、年龄、病理类型、临床分期和MMP-9在肿瘤以及正常组织中的表达采用独立样本t检验。HMGB1和MMP-9的相关分析采用pearson相关分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。结果：经RT-PCR法测定肺癌组织mRNA的表达显示：肺癌组织以及配对癌旁正常组织通过样本的CT值进行相对定量分析,肺癌组织HMGB1的基因表达量明显高于配对正常肺组织,分别为(相对于β-actin)8.62±3.32,3.27±1.74,t=2.219,p<0.05,差异具有统计学意义；经Western blot法测定肺癌组织HMGB1的蛋白表达,结果显示：HMGB1的蛋白表达明显高于配对正常肺组织分别为0.58±0.12,0.21±.72,t=11.7,p<0.001,差异具有统计学意义。免疫组化法测定HMGB1在肺癌组织的表达显示,HMGB1主要表达于肿瘤细胞胞浆,细胞核有少量表达,呈现复合表达。HMGB1在肺癌组织的表达阳性率高于正常组织,阳性率为71%,对照组阳性率为33.3%,P<0.05；且与临床分期密切相关,Ⅲ-Ⅳ期患者肺组织HMGBl表达阳性率为81.0%,高于Ⅰ-Ⅱ期患者,后者阳性率为57.1%两者比较P<0.05; HMGB1的表达与病理类型无关,鳞癌和腺癌组织中HMGB1的表达无统计学差异,P>0.05。免疫组化法测定MMP-9在肺癌组织的表达阳性率76%,高于正常组织,阳性率为23.3%, P<0.05。HMGB1和MMP-9在肺癌组织的表达呈正相关,R=0.399,P<0.01,差异具有统计学意义。结论：在核酸以及蛋白水平上,与癌旁对照组织比较,HMGB1在非小细胞肺癌组织的表达增高。免疫组化显示,Ⅲ-Ⅳ期患HMGB1在肺癌组织的表达阳性率高于Ⅰ-Ⅱ期患者。MMP-9在非小细胞肺癌组织表达比对照组织升高. HMGB1与MMP-9的表达有相关性。HMGB1和MMP-9可能在非小细胞肺癌患者的发生、浸润、转移中起作用,检测肺癌组织HMGB1和MMP-9有助于诊断和疾病进展的判断。第二部分非小细胞肺癌患者血清HMGB1和CEA的水平及两者的相关分析目的：非小细胞肺癌患者外周血HMGB1的水平较少有文献报道,本研究旨在评估非小细胞肺癌患者血清HMGB1的水平,并分析血清HMGB1水平和临床病理特征的关系。CEA是一种重要的肿瘤标志物,目前在多种肿瘤中的临床诊治中广泛应用。为探讨血清HMGB1作为肿瘤标志物的可行性,分析血清HMGB1和CEA水平的相关性。方法：选取178例诊断明确的非小细胞肺癌患者作为试验组,32例健康查体者作为对照组。留取患者及将康对照者空腹静脉血,用ELISA法检测血清HMGB1和CEA的水平。其中71例接受手术治疗的患者,术后2周重复检测血清HMGB1和CEA的水平。采用独立样本t检验分析不同性别、年龄、病理类型、临床分期患者血清HMGBil和CEA的水平。采用pearson相关分析血清HMGB1和CEA水平的相关性。结果：非小细胞肺癌患者血清CEA水平明显高于健康对照者,分别为13.36±26ng/mL,1.76±0.52ng/mL, P<0.05;非小细胞肺癌患者血清HMGB1水平明显高于健康对照者,分别为3.21±0.81ng/mL,2.07±0.65ng/mL, P<0.05。为了评估手术对血清HMGB1和CEA水平的影响,我们检测了71例患者术前、术后的血清HMGB1和CEA。结果显示,术后血清CEA水平(6.08±1.48ng/mL)较术前(6.8±1.57ng/mL)明显下降,P<0.05；术后血清HMGB1水平(2.12±0.54)较术前(2.69±0.71ng/mL)也有下降,P<0.05。不同的病理类型,血清CEA水平有所不同,腺癌患者血清CEA水平高于鳞癌患者,分别为：19.2±3.45ng/mL,5.6±1.62ng/mL(P<0.05).但血清HMGB1水平在不同的病理类型无统计学差别,腺癌患者、鳞癌患者分别为：3.18±0.72ng/mL,3.23±0.78ng/mL,P>0.05。血清HMGB1和CEA水平在不同临床分期的患者都有不同。Ⅲ-Ⅳ期患者、Ⅰ-Ⅱ期患者血清CEA水平分别为：17.71±3.12ng/mL,6.8±1.43ng/mL,P<0.05,差异有统计学意义。Ⅲ-Ⅳ期患者、Ⅰ-Ⅱ期患者血清HMGB1水平分别为：3.55±0.65ng/mL,2.69±0.57ng/mL P<0.05,差异有统计学意义。对血清HMGB1和CEA水平作Pearson相关分析,结果显示,t=-0.21,P=0.856,两者无相关性。结论：我们的数据显示,非小细胞肺癌患者血清HMGB1和CEA水平明显高于健康对照者,Ⅲ-Ⅳ期患者血清HMGB1和CEA水平高于Ⅰ-Ⅱ期患者,腺癌患者CEA水平高于鳞癌患者,腺癌和鳞癌患者血清HMGB1无统计学差异。血清HMGB1有望成为有效的肿瘤标志物,目前未发现血清HMGB1和CEA水平的相关性。全文结论：1.非小细胞肺癌组织中HMGB1的表达在核酸、蛋白水平上均高于癌旁配对对照组织。血清HMGB1水平高于健康对照者。我们的数据显示肺癌组织和血清中HMGB1的水平与临床分期有关,与病理类型无关。2.非小细胞肺癌组织MMP-9表达升高,HMGB1和MMP-9在肺癌组织的表达具有相关性。3.非小细胞肺癌患者血清CEA水平明显高于健康对照者,腺癌患者CEA水平高于鳞癌患者,目前未发现血清HMGB和CEA水平之间的相关性。