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背景和目的转录因子KLF2是一种重要的抑制性血管保护因子,可通过多种途径抑制血管内皮生长因子介导的血管生成反应,维持血流动力学稳定。目前已发现血管生成在肝硬化门脉高压(Portal Hypertention, PHT)中发挥重要作用,不仅影响肝内血管重构,而且促进门脉侧支血管生成,引起PHT的不断进展。因此,KLF2对改善门脉压力有重要意义。目前关于KLF2在PHT及肝脏细胞中的研究甚少。已有研究表明,肝硬化时的内皮细胞表型部分是由血管保护因子的刺激调控的。他汀类药物(statins)作为KLF2的诱导剂,可以引起下游舒血管因子的产量升高,降低门脉压力。还有研究表示,PHT的动物模型中,KLF2的表达上调。但是,关于KLF2在肝硬化PHT中的作用机制还未明确,KLF2对肝内及肝外血管生成的调控,与HIF-Iα NF-κB的关系等,还需要更多的实验进一步证明。本研究的目的是通过对PHT病人及动物模型组织学及血清学标本的检测,筛选与KLF2升高相关的蛋白因子,以此为依据研究KLF2调控血管生成的机制及信号通路,明确他汀类药物上调KLF2表达并改善肝星状细胞活化的作用机理,探讨KLF2对病理性血管生成的作用及机制。材料和方法(1)采集肝硬化PHT行脾切除断流手术病人的门脉系统血管组织,以肝功能正常因胆结石行胆囊切除术病人的肠系膜血管组织作为对照组。收集病人的血清标本。分别建立CCL4、门脉缩窄(Portal Vein Ligation, PVL)、胆总管结手L(Bile Duct Ligation, BDL)三种PHT的动物模型,并收集肝脏、十二指肠、门脉血管组织及脾肾静脉分支血管(Splenorenal shunt, SRS)组织标本。利用免疫组化、PCR以及westernblot技术检测人和动物模型的组织标本中VEGF、HIF-1α及KLF2的mRNA和蛋白表达水平,ELISA检测血清标本中VEGF,IL-8及PLGF分泌因子的表达水平。(2)体外,对人肝星状细胞予以TGF-β因子刺激促进其活化程度,同时用他汀类药物上调KLF2的表达,transwell细胞迁移实验、细胞划痕实验、Brdu增殖实验、PCR、western、ELISA检测星状细胞的活化能力及促血管生成信号通路中相关因子的变化。(3)对人脐静脉内皮细胞予以缺氧刺激,同时应用慢病毒KLF2过表达颗粒转染内皮细胞,通过血管生成实验、transwell迁移实验、MTT增殖实验、westernblot.细胞免疫荧光技术检测细胞的成血管相关改变,从而确定KLF2对内皮血管生成的作用。结果(1)PHT时血管生成及KLF2表达情况：PHT病人的肠系膜血管组织中,VEGF及KLF2蛋白的表达升高。血清标本中,VEGF、PLGF、IL-8分泌因子的表达无明显变化。三种动物模型结果显示,VEGF在肝、肠及血管组织中高表达；HIF-1α在肝脏及小肠组织中表达升高,而在脾肾静脉分支血管组织中表达降低。与之对应,KLF2在小肠中表达升高,在肝脏中表达无明显变化。(2)10ng/ml TGF-β刺激的HSC和对照组比较,细胞增殖效率增长1.2倍；迁移效率增长3倍；a-SMA的表达升高了大约两倍。同时,KLF2的表达明显上升。伴随KLF2的表达升高,KLF2的下游靶蛋白一氧化氮合酶(eNOS)升高；核因子(NF-κB)、缺氧诱导因子(HIF-1α降低；HSC分泌干扰素(INF-τ)增加。而联合给予1uM的辛伐他汀后,HSC细胞的迁移和增殖效率降低了50%；a-SMA的表达有所降低；HSC细胞中KLF2的表达增加了约4倍,eNOS表达有所下降；INF-r的分泌减少,以上差异有统计学意义。(3)KLF2对脐静脉内皮细胞成血管的影响：缺氧刺激之后,对照组的脐静脉内皮细胞血管生成速率,增值及迁移速率增高,而KLF2过表达的细胞中,上述细胞活化效应均明显降低；同时,缺氧刺激可上调HIF-1α及NF-κB的表达,而KLF2可抑制其表达；KLF2下游促血管因子也有所下调,eNOS血管保护因子显著上调。结论(1)在肝硬化PHT的病人及大鼠模型中,VEGF、HIF-1α等促血管生成因子的mRNA及蛋白的表达升高,与此同时,KLF2的表达升高。表明PHT患者体内促血管生成反应较对照组升高,并且可能和KLF2有关。(2)他汀类药物通过上调KLF2的表达,可抑制炎症刺激的肝星状细胞活化及成血管趋势,并抑制下游的促血管因子的表达,从而抑制星状细胞的促血管微环境。(3)脐静脉内皮细胞过表达KLF2后,缺氧刺激导致的促血管效应减弱,下游的促血管生成蛋白表达减少。