新城疫(Newcastle disease,ND)是高度传染并造成重大经济损失的禽类疾病，其病原体是新城疫病毒(Newcastlediseasevirus NDV)。NDV是副黏病毒科的一员，被划归于禽副粘病毒属(Avulavirus)。 不同毒力NDV毒株F蛋白裂解位点的氨基酸序列不同。低毒力株F蛋白都是单碱基裂解位点，即<112>(G/E)(K/R)Q(G/E)RL<117>，只能被有限组织中的细胞外蛋白酶裂解：而中等毒力株与强毒力株F蛋白的裂解位点是多碱基的，即<112>(R/K)RQ(R/K)RF<117>，可以被普遍存在的细胞内蛋白酶裂解。F蛋白的裂解效率被认为是影响NDV毒力的重要因素。因此，一直以来F蛋白的裂解位点都被认为是决定NDV病毒毒力的主要因素。 NDV的HN蛋白是一个多功能蛋白。它具有受体识别和神经氨基酶活性功能。但对其在致病性方面的作用却不为人知．一些研究认为副黏病毒F和HN蛋白之间病毒株型特异性的相互作用是细胞融合所必需的。 负链RNA病毒反向遗传技术(Reverse genetics technology)，即利用与病毒RNA相对应的eDNA在适当细胞内合成具有感染性的负链RNA病毒的方法，是90年代后期出现的新型病毒学技术。本研究就是在建立了NDV反向遗传操作系统(reversegenetic system)的基础上，分别通过F蛋白裂解位点突变、不同毒株F基因替换和HN基因替换以及不同外源基因的插入来研究这些因素对NDV毒力的影响。 1、F蛋白碱裂解位点突变对重组新城疫rLaSota病毒致病力的影响 在成功构建并拯救重组新城疫病毒LaSota株(rLaSota)的基础上，分别设计突变引物将rLaSota F蛋白裂解位点的氨基酸序列由<112>G-R-Q-G-R↓L<117>分别突变为<112>G-R-Q-G-R↓L<117>和<112>R-R-Q-R-R↓<117>，利用拯救rLaSota的辅助质粒pBSNF，pBSP和pBSL与突变株的全基因组质粒共转染BHK-21细胞，救获F蛋白裂解位点突变的重组病毒。并通过测定重组病毒的MDT、ICPI、IVPI等毒力指标来评估其毒力的变化。 2、异源F基因替换对嵌合新城疫LaSota病毒致病性的影响 通过对F蛋白裂解位点突变的研究表明，NDV的毒力不仅仅是由F蛋白裂解位点的氨基酸序列决定的，NDVF蛋白除裂解位点氨基酸序列之外的其它部分也影响NDV的毒力。因此，分别用中等毒力疫苗株Mukteswar、经典强毒株F48E9和现地流行强毒株HB38的F基因替换rLaSota的F基因，利用反向遗传技术拯救F基因替换的重组病毒。通过测定重组病毒的MDT、ICPI、IVPI等毒力指标来评估其毒力的变化。 3、异源HN基因替换对嵌合新城疫LaSota病毒致病性的影响 在研究F蛋白裂解位点突变和不同毒力毒株的F基因替换rLaSota F基因对重组病毒毒力影响的基础上，我们发现NDV的毒力并非由F蛋白唯一决定，因此进一步用中等毒力株Mukteswar的HN基因替换rLaSota的HN基因，以研究HN基因对病毒毒力的影响，不同型毒株F和HN基因之间的相互作用，以及F蛋白裂解位点突变或不突变时，HN基因替换对重组病毒毒力影响。 4、不同外源基因的插入对重组新城疫病毒毒力的影响 在成功建立NDV LaSota株反向遗传操作系统的基础上，可以根据负链RNA病毒的特点来研究病毒的生物学特性与病原性，为此我们根据NDV的基因特征在其基因组的P基因与M基因之间分别插入增强型的绿色荧光蛋白(EGFP)基因、传染性法氏囊病毒VP2基因(IBDV-VP2)和H5亚型高致病力禽流感病毒血凝素(AIV-HA)基因，并拯救重组病毒，用以研究不同性质外源基因插入对重组病毒毒力的影响。 结果表明，F蛋白裂解位点的氨基酸序列可以显著影响病毒的毒力，特别是F蛋白117位氨基酸残基是病毒毒力的一个重要标记，它与之前的五个氨基酸残基之间存在某种相互作用以维持裂解位点的稳定性，同时表明NDV的毒力不仅仅是由F蛋白裂解位点的氨基酸序列决定的。HN基因可以影响病毒的毒力，但本研究结果与Huang等的结果不同，用中等毒力株Mukteswar的HN基因替换rLaSota的HN基因后，重组病毒的毒力有所下降，这表明NOV的毒力是多基因作用的结果，而且似乎与病毒的全基因组有关。外源基因的插入，可以影响病毒的复制与生长，显著降低重组病毒的毒力，但是不同性质的外源基因对重组病毒毒力的影响不同。可以包装到重组病毒囊膜表面的外源糖蛋白对病毒毒力的影响最为显著。