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结直肠癌(colorectal cancer,CRC)又称大肠癌,是最常见的消化道恶性肿瘤之一,是全球发病率已经位居第二,死亡率也上涨至世界第三的恶性肿瘤;CRC患者中大约一半病人在治疗过程中出现肝转移(colorectal liver metastases,CRLM),这也是是导致死亡的主要原因,所以如何防治CRLM攻克CRC延长患者生存时间的重中之重。大量的研究证实微小RNA(microRNAs)在多种肿瘤的发生发展以及侵袭转移中起到了重要调控作用,这也是目前CRC研究的热点。microrna(miRNAs)是一种小的非编码RNA存在于多种细胞内,一旦microRNAs与相关靶基因作用后,将进一步调控下游基因蛋白的表达,目前已发现的miRNAs可以调控人体70%以上的基因表达。在不同组织器官中miRNAs具有特异性,被越来越多地确定为新的生物标志物或治疗的靶点。在几种与癌症相关的microRNA 中,miR-708是其中很小的一个分型,但在很多肿瘤研究中表现了独特的分子生物学作用。miR-708在肿瘤细胞中表达的高低与细胞增殖、迁移、侵袭力,上皮-间质转化(EMT)以及化学药物敏感性等密切相关,这也是miR-708受到更多的关注。锌指E-盒结合同源异形盒 1(zinc finger E-box binding homeobox 1,ZEB1),一种转录因子,是E盒结合蛋白家族中的重要成员之一,可以通过诱导癌细胞的上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transformation,EMT),促进肿瘤的侵袭和转移。根据之前的研究发现ZEB1可能是miR-708的直接靶点,但在CRC中的研究尚未报道,本课题研究旨在探索miR-708和ZEB1在CRC中的表达及其意义并探索两者之间可能存在的靶点关系和相关的作用机制,以期为寻找对CRC,特别是CRLM的治疗新靶点、新策略,并提供理论依据。第一部分miR-708在结直肠癌组织标本的表达及对肿瘤细胞增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭的影响及作用机制材料与方法结直肠癌组织、癌旁组织来自签署过知情同意书的10位结直肠癌患者。经离心震荡法处理血清后,Trizol法提取RNA后备用。首先通过qRT-PCR检测癌组织与癌旁组织、CRC细胞株(HCT-116)与正常肝上皮细胞株(ECT-1)中miR-708表达的差异。在HCT-116中,利用转染技术建立高表达miR-708组(miR-708 mimics 组)和低表达 miR-708 组(miR-708 inhibitor 组)的细胞模型,采用Cell counting kit-8(CCK-8)试剂盒检测细胞增殖;采用流式细胞仪检测细胞周期、凋亡的情况;采用Transwell小室检测细胞迁移和侵袭差异。并通过qRT-PCR和western blot检测处理后的HCT-116细胞中与细胞凋亡相关的Bax和Bd-2在mRNA和蛋白水平表达的差异以及与EMT相关的E-cadherin和N--cadherin在mRNA和蛋白水平表达的差异。结果首先与癌旁组织相比,结直肠癌组织中miR-708的表达明显降低,通过检测发现CRC细胞株(HCT-116)中miR-708的表达较正常肝上皮细胞株(ECT-1)明显降低。再通过CCK-8试剂盒检测发现miR-708 mimics组较miR-708 inhibitor组细胞增殖数量明显减少。接着通过qRT-PCR、流式细胞仪、Transwell小室结果显示与相应的阴性对照转染组相比,经过转染后高表达miR-708的CRC细胞能明显减少增殖,延长细胞周期,促进细胞凋亡,降低肿瘤迁移和侵袭的能力。然后通过western blot和qRT-PCR检测与细胞凋亡相关的Bax和Bcl-2的表达结果显示miR-708 mimics组可显著增加促凋亡基因Bax的表达,降低抗凋亡基因Bcl-2的表达,而miR-708 inhibitor组则得到相反的结果。最后从蛋白和mRNA水平检测与EMT相关的E-cadherin和N--cadherin的表达,结果显示miR-708 mimics组可增加E-cadherin的表达,同时降低N--cadherin的表达,而miR-708 inhibitor则得到相反的结果。结论miR-708在结直肠癌组织中表达显著降低,在CRC细胞株中高表达miR-708可降低肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭的能力,同时细胞凋亡数量显著增加。miR-708在CRC细胞株中表达水平的高低与肿瘤恶性程度呈直接负相关。另外,miR-708可通过上调促凋亡蛋白Bax的表达和下调抗凋亡蛋白Bcl-2的作用机制促进CRC细胞凋亡;同时miR-708还可通过增加E-cadherin的表达和降低N--cadherin的表达抑制肿瘤细胞发生EMT,从而降低CRC细胞迁移和侵袭能力。这些结果进一步强调了 miR-708促进CRC细胞凋亡,并抑制细胞增殖、迁移和侵袭。第二部分ZEB1在结直肠癌组织标本的表达及对肿瘤细胞增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭的影响及作用机制经过第一部分的研究我们发现miR-708在CRC细胞株中表达水平的高低与肿瘤恶性程度呈负相关,特别是在调控CRC细胞发生EMT的过程中表现突出。而ZEB1是EMT的重要驱动因子,通过诱导肿瘤细胞发生EMT,促进肿瘤的侵袭和转移。本部分研究主要通过进一步探索与EMT密切相关的ZEB1在CRC组织中表达的差异及对CRC细胞的影响,以探讨ZEB1的表达高低对CRC细胞凋亡、迁移和侵袭的影响及可能的作用机制。材料与方法结直肠癌组织、癌旁组织来自签署过知情同意书的10位结直肠癌患者。经离心震荡法处理血清后,Trizol法提取RNA后备用。首先通过免疫组织化学染色的方法检测癌组织与癌旁组织中ZEB1表达的差异,再通过qRT-PCR和western blot检测癌组织与癌旁组织、CRC细胞株(HCT-116)与正常肝上皮细胞株(ECT-1)中ZEB1蛋白和基因表达的差异。再利用细胞质粒转染技术,构建ZEB1表达沉默组(ZEB1 siRNA组)和过表达组(ZEB1 OE组)CRC细胞株模型,采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖差异;采用流式细胞仪检查细胞周期和细胞凋亡的情况;采用Transwell小室检测细胞迁移和侵袭差异。最后再通过qRT-PCR和western blot检测ZEB1 siRNA组和ZEB1 OE组细胞中与细胞凋亡相关的Bax和Bcl-2在mRNA和蛋白水平表达的差异以及与EMT相关的E-cadherin和N--cadherin在mRNA和蛋白水平表达的差异。结果首先免疫组化的结果显示结肠癌组织中ZEB1的表达较癌旁组织明显增加,此结果再通过qRT-PCR和western blot两种方法在蛋白水平及基因水平上得到了验证。另外通过qRT-PCR和western blot检测发现CRC细胞株(HCT-116)中ZEB1的表达较正常肝上皮细胞株(ECT-1)明显增加。通过细胞质粒转染技术成功构建ZEB1 siRNA组和ZEB1 OE组后,先利用CCK-8试剂盒检测发现ZEB1 siRNA组较对照组细胞增殖数量明显减少。流式细胞仪检查细胞周期发现ZEB1 siRNA组在细胞周期中的G1期明显延长并且增加肿瘤细胞凋亡。Transwell小室结果显示ZEB1 siRNA组细胞迁移和侵袭的能力较ZEB1 OE组相比明显降低。通过western blot和qRT-PCR检测与细胞凋亡相关的Bax和Bcl-2的表达结果显示与对照组相比,ZEB1 siRNA组中促凋亡基因Bax的表达明显升高而抗凋亡基因Bcl-2的表达明显降低;而ZEBl OE组则得到相反的结果。最后从蛋白和mRNA水平检测与EMT相关的E-cadherin和N-cadherin的表达,结果显示ZEB1 siRNA组CRC细胞中E-cadherin的表达明显增加而N-cadherin的表达显著降低,而ZEB1 OE组则得到相反的结果。结论ZEB1在结直肠癌组织中的表达显著增高,在CRC细胞系中沉默ZEB1表达可降低肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭的能力,延长细胞周期,增加肿瘤细胞凋亡数量。ZEB1在CRC细胞株中表达水平的高低与肿瘤恶性程度呈直接正相关。另外,ZEB1可通过降低促凋亡基因Bax的表达和增加抗凋亡蛋白Bcl-2抑制肿瘤细胞凋亡;同时ZEB1还可通过降低E-cadherin的表达和增加N--cadherin的表达促进肿瘤细胞发生EMT,从而增加CRC细胞迁移和侵袭能力。这些结果进一步强调了ZEB1对CRC细胞的增殖、迁移和侵袭的过程中起到促进作用,并抑制肿瘤细胞凋亡。第三部分miR-708直接靶向ZEB1并通过抑制AKT/mTOR信号通路促进结直肠癌细胞凋亡经过前面两个部分的研究我们发现miR-708对CRC细胞的增殖、迁移和侵袭的过程中起到抑制作用并促进肿瘤细胞凋亡,而ZEB1对CRC细胞的作用正好相反,那么两者之间是否存在一定的作用关系引起了我们团队的注意。如果两者存在直接的靶向关系,那它们又是如何在CRC细胞中发挥作用的?基于上述研究基础和实验假设我们设计了第三部分实验,希望通过验证miR-708与ZEB1的靶向关系,进一步探索两者之间存在的联系,以及潜在可能的作用机制或对AKT/mTOR信号通路的影响。材料与方法利用生物数据库软件分析miR-708与ZEB1之间是否存在可能的靶向关系,再采用双荧光素酶报告基因实验验证两者的靶向关系:通过构建ZEB1基因3’-UTR荧光素酶野生型质粒载体,与miR-708 mimics同时转染进HCT-116细胞中检测细胞中ZEB1的相对荧光表达量的变化。利用之前建立的CRC细胞模型miR-708 mimics 组和 miR-708 inhibitor 组,通过 western blot 和 qRT-PCR方法检测两组细胞模型中ZEB1 mRNA和蛋白水平表达的变化。为了说明miR-708和ZEB1对AKT/mTOR细胞信号通路的影响,我们采用western blot技术检测miR-708 mimics和miR-708 inhibitor两组细胞中与AKT/mTOR细胞信号通路密切相关的p-AKT和p-mTOR蛋白表达的差异。同样的方法检测ZEB1 siRNA和ZEB1 OE两组细胞中p-AKT和p-mTOR蛋白表达的差异。结果首先通过TargetScan 7.0和miRBase生物数据库的分析结果显示ZEB1是miR-708的一个潜在功能性靶点之一,并且预测出ZEB1 mRNA 3’-UTR与miR-708的结合位点。为进一步验证ZEB1与miR-708的相关性,采用了双荧光素酶报告基因试验,结果显示:与阴性对照共转染组相比miR-708 mimics和ZEB1荧光素酶野生型质粒载体共转染能显著降低HCT-116细胞中ZEB1的相对荧光表达量。然后通过western blot检测miR-708 mimics组中ZEB1的表达明显降低,而miR-708 inhibitor组中ZEB1的表达明显增高。最后通过western blot的方法检测与AKT/mTOR细胞信号通路密切相关的p-AKT和p-mTOR蛋白表达的结果显示miR-708 mimics组细胞中p-AKT和p-mTOR蛋白表达明显降低,而miR-708 inhibitor组细胞中p-AKT和p-mTOR蛋白表达明显升高。同样的方法检测结果显示,ZEB1 siRNA组细胞中p-AKT和p-mTOR蛋白表达明显降低,ZEB1 OE组细胞中p-AKT和p-mTOR蛋白表达均明显升高。结论ZEB1在CRC细胞中可能是miR-708直接作用的靶点之一,同时miR-708和ZEB1两者的表达呈直接负相关。最后我们发现高表达miR-708和沉默ZEB1表达均可降低CRC细胞中p-AKT和p-mTOR蛋白的表达从而抑制AKT/mTOR细胞信号通路最终诱导CRC细胞凋亡。那么我们可以推测出一条新的潜在的抗结直肠癌的信号通路,即miR-708-ZEB1-AKT/mTOR信号通路。总结相比结直肠癌旁组织,癌组织中miR-708低表达,而ZEB1高表达。miR-708可促进CRC细胞凋亡,并抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭;相反ZEB1对CRC细胞的增殖、迁移和侵袭的过程中起到促进作用,并抑制肿瘤细胞凋亡。ZEB1在CRC细胞中可能是miR-708直接作用的靶点之一,同时miR-708和ZEB1两者的表达呈直接负相关。miR-708可直接靶向ZEB1并通过抑制AKT/mTOR信号通路促进结直肠癌细胞凋亡抑制CRC细胞侵袭转移,即miR-708-ZEB1-AKT/mTOR抗结直肠癌信号通路。