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目的观察Wnt经典通路对ARDS时MSC向肺上皮细胞定向分化时细胞自噬的调节作用,并观察MSC的PTEN-PI3K/Akt/mTOR通路信号分子变化,明确Wnt经典通路对MSC向肺泡上皮细胞定向分化过程中细胞自噬调控的分子机制,为进一步提高MSC治疗ARDS的疗效提供实验基础。方法首先,用全骨髓细胞贴壁法进行MSC的培养和纯化,并通过观察形态(MSC呈梭形,类似于成纤维细胞)、用流式细胞仪检测其表面标志物(CD90[+]、CD29[+]、CD45[-])和是否能诱导分化为脂肪细胞和骨细胞来鉴定是否为MSC。其次,将8~10周的C57BL/c小鼠分为对照组和实验组,实验组通过气管注入5mg/Kg的LPS复ARDS模型,对照组气管注入等体积的NS,来建立ARDS小鼠模型。再将ARDS小鼠模型复制后1h将小鼠处死,提取肺细胞。然后,将悬挂式transwell小室,将小鼠肺细胞、小鼠骨髓MSC建立体外共培养实验模型。之后,将体外培养诱导MSC向肺上皮细胞定向分化模型进行以下分组和处理:a.空白组:MSC单独培养;b.对照组:MSC+正常肺细胞;c.损伤肺细胞组:MSC+LPS诱导ARDS的肺细胞;d.LiCl组:MSC+LPS诱导ARDS的肺细胞+浓度4mmol/L的LiCl激活经典Wnt通路;e.DKK-1组:MSC+LPS诱导ARDS的肺细胞+浓度20ng/mL的DKK-1抑制经典Wnt通路;在实验过程中,通过以下方法检测细胞自噬活性:a.培养后第0、1、3、7天,在透射电子显微镜下观察细胞中自噬体的变化;b.培养后第1、3、7天,运用western blot检测MSC自噬标记蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ及Beclin-l表达;c.培养后第1、3、7天,运用mRFP-GFP-LC3双荧光自噬指示体系标记及追踪LC3的变化。除此之外,还检测PI3K/Akt/mTOR通路相关信号分子:培养后第1、3、7天运用western blot检测MSC中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR及p-mTOR的表达,了解MSC向肺上皮细胞分化过程中PI3K/Akt/mTOR通路的激活情况。检测细胞的增殖情况:描记生长曲线。之后,测定细胞的侵袭率。结果与正常对照组及损伤肺细胞组比较,LiCl激活经典Wnt通路的LiCl组的MSC自噬标记蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ及Beclin-l表达明显增加,而自噬相关的信号分子p-PI3K、p-Akt、p-mTOR的蛋白表达明显下调,而DKK-1抑制经典Wnt通路的DKK-1组MSC自噬标记蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ及Beclin-l表达减少,而自噬相关信号分子p-PI3K、p-Akt、p-mTOR的蛋白表达明显上调。并且激活Wnt经典通路增加MSC细胞存活及迁移能力结论LiCl激活MSC的Wnt经典通路导致细胞自噬活性增加,激活Wnt经典通路能下调细胞自噬调控信号途径PI3K/Akt/mTOR信号分子表达,并增加MSC细胞存活及迁移能力,提示WNT经典通路可能通过PI3K/Akt/mTOR信号通路增加ARDS时MSC定向分化为肺上皮细胞过程中的细胞自噬活性,并增加MSC细胞存活及迁移能力。