实验目的：肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上最为常见的一种原发性恶性肿瘤,由于它手术后依然具有较高的复发性和转移率以及缺乏早期诊断的生物标记,故是最致命的疾病之一。肝细胞肝癌恶性程度较高,全球每年HCC死亡病例数高达600,000,病死率仅次于肺癌、胃癌居肿瘤相关死亡癌症的第三位。A20即肿瘤坏死因子a诱导蛋白3,是一种重要的免疫负调控因子。最初,A20是在肿瘤坏死因子a (TNF-a)诱导人脐静脉内皮细胞反应中检测到的一种诱导性表达蛋白,因此也被称为TNFAIP3。它于1990年首次作为抗凋亡分子被鉴定出来。人类A20基因定位于6号染色体长臂第23位,其cDNA序列为4000bp,开放阅读框为2370bp,编码790氨基酸的90kDa蛋白。A20的氨基酸序列具有高度保守性,通过电镜结构我们发现其N端具有卵巢肿瘤(OTU)结构域,其晶体结构显示含有10个b-螺旋和10个a-螺旋,此部位是泛素结合部位,具有去泛素化蛋白酶活性作用；而其C端则具有7个连续的Cys2-Cys2锌指结构域,具有泛素连接酶活性。肿瘤细胞的转移是一个多步骤,多因素的复杂过程,首先是肿瘤组织内生成新生血管,然后肿瘤细胞从原发灶脱落,寻找时机侵入周围基底膜和细胞外基质,从而使其进入血管和淋巴管中,随着血液循环,肿瘤细胞可到达身体各器官和组织,在某一处肿瘤细胞从血管和淋巴管中穿出进入相应的靶器官然后增殖生长成为新的转移灶。在这一系列的复杂过程中,有一些分子发挥着重要作用,比如细胞粘附分子,如钙黏蛋白家族分子、整合素分子；大量文献表明,钙黏蛋白家族分子(E-cadherin, N-cadherin)主要介导细胞与细胞之间的相互作用,其表达的变化与肿瘤的侵袭转移密切相关。整合素分子主要介导细胞与细胞外基质问的相互作用,同时也介导细胞间的相互作用。大量文献表明TNF-α可通过PI3K/Akt通路；NF-κB信号通路；STAT3信号通路等多条通路来调节肿瘤细胞的EMT现象从而增强肿瘤细胞的运动能力；同时A20是典型的NF-κB信号通路抑制剂,它通过其双功能泛素编辑酶的作用可以抑制TNF-α所激活的NF-κB信号通路。因此我们初步假设A20可否抑制TNFa增强的肿瘤细胞的运动能力。由于肝癌具有较高的复发性和转移率,恶性程度较高难以治愈,是世界范围研究的热点。所以我们把关注点集中在肝癌细胞上。首先我们选取75例肝癌病人的组织切片,分别取其癌组织和癌旁组织,运用免疫组化技术检测A20在癌和癌旁的表达区别,实验结果提示我们A20可能在肝癌的发生发展中起着一定的作用。由于我们目标在A20和肝癌转移方面的联系,随后我们又选取106例肝癌病人的癌组织切片,采用免疫组化双染技术,检测A20和CD34,选出可以观察到肿瘤细胞微血管侵犯的片子,然后对选出的片子进行统计,分析侵入微血管和未侵入血管的肿瘤细胞其A20的表达的差异。随后我们进行体外实验,对多种肝癌细胞进行检测A20的表达情况,确定高表达和低表达细胞系。选取A20低表达细胞系SMMC-7721和huh-7,设计四组,分别为转染空白质粒pRK5组,转染A20组,转染空白质粒pRK5组,转染A20组。前两组为对照不做处理,后两组在转染24h后加入TNFa刺激,作用浓度为50ng/ml,作用时间为24h。随后对其进行细胞迁移和侵袭实验,观察A20能否抑制肿瘤细胞的运动能力。然后研究其机制,主要分为两方面：其一,A20能否抑制TNF诱导的肝癌细胞的EMT进程,选用两种标志物上皮型钙粘蛋白(E-cadherin)和神经型钙粘蛋白(N-cadherin)。其二,A20能否抑制TNF诱导的肝癌细胞的FAK的活化,选用两个磷酸化位点pFAK(397),pFAK(861)。从蛋白水平来检测其活化状态。再选取A20高表达细胞系Hep3B,对其进行siRNA干扰,也是分成四组,处理方法和过表达体系一致。随后检测相关指标。最后,我们进行体内实验,选用高转移肝癌细胞系HCCLM3,皮下接种裸鼠并注射TNFa和A20表达质粒,一段时间后处死小鼠,制备肿瘤组织切片用免疫组化检测CD34,观察肿瘤细胞的微血管侵犯。通过一系列实验我们可以初步证明A20可抑制TNFa增强的肿瘤细胞的运动能力,并且是通过影响EMT和FAK来实现的。实验方法：一、采用肝癌临床标本检测A20的表达与肝癌转移的相关性。1、A,20与肝癌的发生发展间的相关性(1)肝癌病人组织芯片此次实验所使用的肝癌病人组织芯片为75例病人的临床标本包括其肝癌组织和癌旁组织,并附有病人的详细资料。(2)采用免疫组织化学方法检测组织芯片中A20在癌组织和癌旁组织的表达差异。采用免疫组化技术检测肝癌组织芯片中A20的表达情况。此芯片经过3小时75度烘烤后进行脱蜡与水化,此一抗为A20 (abeam兔抗人单克隆抗体,1：500稀释,)。次日加入二抗(中杉金桥,山羊抗兔),用DAB染色剂进行染色,并用苏木素染液染其细胞核,最后氨水返蓝,封片保存。2、A,20和肝癌的运动性的相关性(1)肝癌病人组织芯片此次实验使用106例肝癌病人组织切片均来自于齐鲁医院包括,并附有病人的详细资料。(2)采用免疫组化双染方法检测中浸入血管中肿瘤细胞A20的表达与血管外的差异运用免疫组化双染试剂盒(购于中杉金桥公司)分别标记A20和CD34,其中A20购于abeam公司,为兔抗人单克隆抗体,1：400稀释使用；CD34购于中杉金桥公司,为鼠抗人单克隆抗体,1：60稀释使用。二抗分别为山羊抗兔和山羊抗鼠,其中A20被染成棕色,CD34被染成红色。其于步骤一致。(3)采用免疫组化双染方法鉴定中浸入血管中的是否是肿瘤细胞仍然使用免疫组化双染试剂盒(购于中杉金桥公司)分别标记CK8/18和CD34,其中CK8/18购于中杉金桥公司,为鼠抗人单克隆抗体,1：100稀释使用；CD34购于abcam公司,为兔抗人单克隆抗体,1：350稀释使用。二抗分别为山羊抗兔和山羊抗鼠,其中CK8/18被染成棕色,CD34被染成红色。其于步骤一致。二、选择确定及培养A20高表达细胞株和低表达细胞株选择肝癌细胞系为SMMC-7721、HEL-7402、huh-7、Hep-3B、HepG2、 HCCLM3,经过蛋白水平检测确定A20高表达细胞株和低表达细胞株。其中肝癌细胞系SMMC-7721、HEL-7402和HepG2均购于中国科学院上海细胞库,使用RPMI 1640培养基加入青霉素氯霉素双抗及10%FBS,于370C、5%CO2孵箱中培养；huh-7购于中国科学院上海细胞库,使用DMEM培养基加入青霉素氯霉素双抗及10%FBS培养；Hep-3B购于中国科学院上海细胞库,使用MEM培养基加入青霉素氯霉素双抗及10%FBS培养；HCCLM3购于武汉细胞库,使用DMEM培养基加入青霉素氯霉素双抗及10%FBS培养三、A20对肝癌细胞系运动能力的作用及其机制研究1、发现现象--运用细胞迁移实验检测A20影响TNF-a诱导的肝癌细胞运动能力选择A20低表达细胞株SMMC-7721和huh-7,对其转染A20质粒使其过表达,随后对其进行细胞迁移和侵袭实验,观察A20能否抑制肿瘤细胞的运动能力。再选取A20高表达细胞系Hep3B,对其shRNA干扰,处理方法和过表达体系一致。随后检测相关指标。2、寻找机制-从蛋白和RNA水平检测相关通路的变化(1)A20影响TNF-a诱导的肝癌细胞EMT改变a)采用PCR和Western-blot检测A20对EMT相关分子作用情况仍然采用A20过表达体系和干扰体系,分组和处理方式与上述一致。选用EMT相关指标上皮型钙粘蛋白(E-cadherin)和神经型钙粘蛋白(N-cadherin)。分别从RNA和蛋白水平检测A20的作用。b)进一步证明A20是通过NF-κB信号通路来作用于EMT相关分子选用细胞系及分组处理方法与上述一致,此次使用共转染的方法,用脂质体包裹P65小干扰和A20质粒或A20小干扰shRNA一同转入细胞系中。其共转染体系分组为A20高表达体系：PRK5+siNC, A20+siNC, PRK5+siP65, A20+siP65;A20低表达体系：shNC+siNC, shA20+siNC, shNC+siP65, shA20+siP65。之后再收取蛋白,用Western-blot方法检测A20是否通过NF-κB信号通路来作用于EMT相关分子。(2)A20影响TNF-a诱导的肝癌细胞FAK的活性a)采用Western-blot技术检测A20对FAK的作用选用相应的A20高表达细胞株和低表达细胞株对其进行过表达和小干扰。分组和处理方式与上述一致。对于研究对象黏着般激酶FAK,选用两个磷酸化位点pFAK(397),pFAK(861)。从蛋白水平来检测A20对其作用。b)证明A20是通过结合RIPK1来对FAK发挥作用首先选用肝癌细胞SMMC-7721,接种到6孔板中,待其贴壁后使用脂质体包裹RIPK1小干扰进入细胞中,采用Western-blot检测RIPK1的干扰效率。继续选用SMMC-7721将其按一定数目接种到6孔板中,此次实验分三组,空白对照,只加入TNFa组,加入TNFa及RIPK1干扰组。采用Western-blot方法来验证在TNFa刺激下当RIPK1被干扰后,FAK的磷酸化水平是否降低。随后,我们证明A20是否可以通过作用于RIPK1来影响FAK的磷酸化。仍然选用SMMC-7721细胞系,按上述方法接种到6孔细胞培养板中,次日待其贴壁后进行共转染,使用脂质体LIP2000包裹RIPK1小干扰和A20质粒共同进入细胞中,24小时后加入TNFa刺激,一段时间后收取蛋白,采用Western-blot方法来验证A20是否可以通过作用于RIPK1来影响FAK的磷酸化。此次实验分为四组,均加入TNFa刺激分别为：PRK5+siNC, A20+siNC, PRK5+siRIPK1, A20+ siRIPK1。c)A20是通过作用FAK来影响RAC1活性选用相应的AA20高表达细胞株Hep-3B和低表达细胞株SMMC-7721, huh-7对其进行过表达和小干扰。分组和处理方式与上述一致。将细胞消化后种于直径10cm培养皿中,贴壁后转染A20,加刺激,然后按RAC1活性试剂盒方法收取蛋白检测其活性。四、体内实验验证A20对肝癌细胞运动性的作用(1)裸鼠肿瘤模型的构建购买裸鼠10只,购于北京华阜康生物科技股份有限公司,周龄4-6周,雄性。准备肝癌细胞系HCCLM3,培养传代,状态良好后将其腋下注射打人裸鼠皮下,细胞数为每只1×107个,两周后肿瘤形成,分为两组,开始分别注射空白质粒pRK5和A20质粒两天一次。同时注射TNF α。质粒注射5次后处死裸鼠,取出肿瘤块,石蜡包埋切片。(2)免疫组织化学技术检测肿瘤细胞的微血管侵犯此次肿瘤标本共10例,对照组和实验组各5例；对照组为空白质粒pRK5注射组和实验组为重组质粒pRK5-A20注射组,采用免疫组化技术检测肿瘤标本中CD34的表达情况。此石蜡切片经过2小时75度烘烤后进行脱蜡,水化,高温高压热修复,冷却后在进行阻断其内源性过氧化物酶,PBS清洗用山羊血清封闭其非特异性位点,室温40分钟后加入一抗4℃过夜。此一抗为CD34 (abcam鼠抗兔单克隆抗体,1：200稀释)。次日加入二抗(中杉金桥,山羊抗鼠),用DAB染色剂进行染色,并用苏木素染液染其细胞核,最后氨水返蓝,封片保存。实验结果：一A20与肝癌的转移具有相关性在肝癌病人组织芯片中,75例病人的肝癌组织和癌旁组织检测A20的表达差异,选择相应视野通过统计分析得出A20在癌旁组织中的表达显著高于其在肝癌组织中的表达(P<0.001)。我们探究A20能否抑制肝癌的转移,选用106例肝癌病人组织切片进行免疫组化双染,目的蛋白为A20和血管内皮CD34,其中A20被染成棕色,CD34被染成红色。其中有89例肝癌病人组织切片可以观察到肿瘤细胞的微血管侵犯。统计分析可以得出进入到血管中的肿瘤细胞其A20的表达显著低于未侵入血管中的肿瘤细胞A20的表达(P<0.001)。这提示A20可能对肝癌细胞的转移起到抑制作用。为了进一步确定侵入血管中的是肿瘤细胞而不是其他间质细胞,我们采用组化双染,靶蛋白为CD34和角蛋白CK8/18,其中CK8/18蛋白染成棕色,CD34被染成红色。结果发现侵入血管中的细胞可表达角蛋白CK8/18,这表明侵入血管中的细胞是肿瘤细胞。二肝癌细胞系中A20表达差异的鉴定我们选用五种肝癌细胞系SMMC-7721、HEL-7402、huh-7、Hep-3B、HCCLM3通过蛋白水平检测Hep-3B为A20高表达细胞株,SMMC-7721、HEL-7402、huh-7、 HCCLM3为A20低表达细胞株。因此在体外实验过程中我们选用SMMC-7721、 huh-7构建A20过表达体系,选用Hep-3B进行A20干扰使其低表达。在体内实验时选用肝癌细胞高转移细胞系HCCLM3构建肿瘤模型。三A20能够抑制TNF a诱导的肝癌细胞的侵袭和迁移体外实验验证A20对肝癌侵袭和迁移实验的研究采用细胞跨膜的方法即transwell小室来实施：结果显示在TNFa刺激下,当高表达A20时,A20能够抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力：当干扰A20表达后,干扰组的肝癌细胞其迁移和侵袭能力则会增强。然而,在未刺激组无论A20表达高低与否,其对肝癌细胞的运动能力没有作用。因此我们认为A20可抑制由TNFa诱导的肝癌细胞的运动能力。四A20主要通过影响EMT进程和FAK的活化来抑制肝癌细胞的运动能力对其机制研究发现：首先A20是典型的NF-κB抑制剂,它能抑制TNFa引起的NF-κB的活化。随后通过查阅文献我们猜想：A20可能通过影响肝癌细胞的EMT进程和FAK-RAC1通路来抑制TNFα诱导的肝癌细胞的侵袭和迁移。我们选取A20过表达和低表达两种细胞体系来验证猜想。首先,实验发现A20能抑制TNFa诱导的肝癌细胞的EMT进程,即在蛋白水平和RNA水平均能上调E-cad,下调N-cad。随后,我们阻断NF-κB通路,发现A20抑制EMT相关分子的现象消失了。说明A20通过阻断NF-κB通路来抑制TNFa诱导的肝癌细胞EMT进程。其次,实验发现A20可以降低TNFa诱导的FAK的磷酸化水平,同时降低了FAK下游的RAC1-GTP活性。我们还发现当沉默RIPK1表达后A20对TNFa诱导的FAK活化的抑制作用明显减弱了,这表明A20可能通过对RIPK1的泛素化降解,影响RIPK1和FAK的结合,进而抑制FAK的活化。而在未刺激组中无论A20表达高低与否,其对EMT分子和FAK、RAC1的表达均无明显作用。综上所述,我们认为A20可通过抑制TNFa引起的NF-κB的活化来阻碍肝癌细胞的EMT进程,还可以通过RIPK1来阻断FAK-RAC1通路的活化,从而最终抑制TNFa诱导的肝癌细胞的运动能力。五体内实验验证A20对肝癌运动能力的作用在体外细胞实验已证明A20可以通过作用于EMT和FAK抑制TNFa诱导的肝癌细胞的运动能力,因此我们通过裸鼠皮下成瘤实验来进一步验证A20的功能。实验结果显示,与对照组(注射空白载体pRK5)相比,实验组(注射pRK5-A20质粒)肿瘤细胞微血管侵犯的数量显著减少。这表明A20对肝癌运动能力的抑制作用。实验结论：一A20抑制由TNFa诱导的肝癌细胞的运动能力。二A20通过影响EMT进程来抑制TNFa诱导的肝癌细胞的运动能力。三A20通过作用RIPK1/FAK/RAC通路来抑制TNFa诱导的肝癌细胞的运动能力。