基因测序技术的发展为分子标记研究提供了海量数据支撑,依托于组学分析的研究方法已成为一项重要途径。微卫星(Microsatellite)又称简单重复序列(Simple sequence repeats,SSRs),是由核心序列(Core sequences)与高度保守的两端侧翼序列(Flanking sequences)构成。微卫星标记由于其分布广泛、稳定性强、共显性遗传和可重复性等优点,一直以来广泛应用于昆虫种群遗传学和微进化等众多领域研究中。多态性微卫星的挖掘与筛选在微卫星相关研究中十分重要,目前缺乏基于基因组数据和转录组数据直接获取多态性微卫星的方法,鲜有专门分析基因组多态性微卫星位点特征、规律及功能的报道,亟待开发从基因组、转录组数据中直接挖掘多态性微卫星的工具,为了解决这些问题,本研究分别基于昆虫基因组和转录组数据,开发了两种新的多态性微卫星位点挖掘方法,并通过引物设计、DNA提取和微卫星分型(Microsatellite genotyping)等实验,验证了新方法的有效性;以昆虫基因组重测序数据为依托,对基因组中各区域微卫星的特征及功能进行了分析;发现编码区微卫星突变造成的移码突变或非移码突变对氨基酸序列产生重要的影响,可能导致氨基酸序列结构和功能发生变化;部分基因的5’侧翼区微卫星能够通过长度改变影响基因的表达水平;本研究还基于基因表达谱筛选出在豌豆蚜蚜型分化及蚜虫表型可塑性中可能发挥重要作用的核心基因。主要工作如下:1.开发并验证了一种基于基因组及重测序数据的多态性微卫星位点挖掘新软件本研究开发了一种挖掘基因组多态性微卫星的软件GSSRt(Genomic SSR Mining Tool),该软件主要由5个子程序构成,以Samtools mpileup+Bcftools流程获取indel calling结果和研究对象的参考基因组作为输入文件,软件操作简单,且运行速度较快。为了验证该软件的实用性和准确性,对本研究组参与完成测序与分析的苹果蠹蛾Cydia pomonella基因组及重测序数据中的微卫星进行了分析,挖掘得到了125219个多态性微卫星位点,其中32408为高度多态性位点;从这些高度多态性位点中挑选出77个位点,提取苹果蠹蛾试虫基因组DNA,设计微卫星引物,对挑选出的77个微卫星位点的多态性进行了实验验证。研究结果显示,在验证的77个位点中,共有73个位点在供试样本中展现出多态性,占全部位点的94.81%;PIC均值为0.5610,PIC>0.5(即高度多态性)的位点为58个,占比为75.32%。研究结果表明该方法能够在基因组水平上高效、准确的挖掘微卫星位点的多态性信息,这对基因组中多态性微卫星位点的挖掘及应用研究具有重要意义。2.昆虫基因组微卫星位点的特征分析本研究利用新开发的GSSRt软件,对6种昆虫基因组及重测序数据进行分析。结果显示,6种昆虫中,二核苷酸微卫星中的多态性微卫星所占的比率高于其它重复类型,之后依次为单核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸微卫星;除二核苷酸重复外,其它类型微卫星中多态性位点所占的比率随微卫星基序长度的增加逐渐降低;对6种昆虫基因组多态性微卫星位点进行定位,发现大部分微卫星位点分布在基因间区;基因内的微卫星主要分布在内含子区,该区中的微卫星占各物种中微卫星总数的比值在3.51%～22.12%之间;外显子区的微卫星数量最少(0.45%～7.05%),此外,外显子区多态性位点所占比率也远低于基因间区和内含子区。对本研究组参与完成的苹果蠹蛾甲基谷硫磷和溴氰菊酯抗药性品系与敏感品系重测序数据中的微卫星位点的多态性信息进行比较分析发现,与敏感品系相比,两种抗性品系中检测出的微卫星位点数存在显著差异,说明微卫星的变化和苹果蠹蛾抗药性水平的变化相关;对苹果蠹蛾基因组编码区微卫星位点进行分析,得到59个编码区多态性微卫星位点,这些位点分布在24条苹果蠹蛾染色体,其中染色体13上的编码区多态性微卫星位点数量最多;在59个位点中,8个多态性微卫星在两种抗性品系与敏感品系中的基因型存在显著差异,部分微卫星所在的基因编码的蛋白参与重要的外源和内源物质代谢,说明微卫星编码区重复序列长度的改变可能对相关蛋白的结构和功能产生影响,微卫星位点的变化影响蛋白质功能。3.昆虫CYP基因家族5’侧翼区微卫星位点的研究以往研究发现,昆虫一些特定基因的5’侧翼区的微卫星能够通过长度的变化影响基因的表达,但目前缺乏对具体基因家族5’侧翼区微卫星的系统深入的研究。细胞色素P450(Cytochrome P450 Protein,CYP)基因在多种内源性和外源性底物的代谢中发挥关键作用。本研究以昆虫CYP基因为例,分析基因家族5’侧翼区微卫星位点的特征。首先对27种昆虫基因组CYP基因家族进行重新注释分析,根据获取的CYP基因在基因组中的位点信息提取其5’侧翼区序列,共检测到1216个微卫星,这些微卫星分布在643条5’侧翼区序列上,发生频率为27.19%。其中,单核苷酸重复微卫星数量最多,其余依次为二核苷酸、三核苷酸,四核苷酸、六核苷酸和五核苷酸重复。在近缘物种基因5’侧翼区中跨物种共有微卫星,可能是调控基因表达的“调节钮”。为了对这类跨物种共有微卫星进行系统分析,本研究对27种昆虫中4种蚜虫的CYP基因家族进一步展开分析,通过已构建的系统发育树和多重序列比对结果,鉴定出16组豌豆蚜Acyrthosiphon pisum、桃蚜Myzus persicae、樱桃蚜Myzus cerasi和麦双尾蚜Diuraphis noxia中的CYP基因家族的直系同源组,在其中3组中筛选出蚜虫中跨物种共有微卫星位点,其中两组中微卫星位点的特征与传统的近缘物种共有微卫星位点的特征一致,即微卫星基序类型相同且微卫星两端侧翼序列高度相似;而另一组虽然在5’侧翼区的相对位置高度一致且微卫星基序类型相同,但两端侧翼序列在物种间差异较大,这类特殊的跨物种共有微卫星的特征与已有跨物种共有微卫星序列特征不同。为了研究这一类特殊的跨物种共有微卫星,进一步挖掘获得了4种蚜虫的直系同源基因组,并从中筛选出了58个4种蚜虫中共有的微卫星位点,其中55个微卫星的双端侧翼序列在物种间高度相似,这些位点的特征与传统的跨物种共有微卫星相似;而另外3个位点,与新发现的特殊的跨物种共有微卫星特征一致,表明这一类近缘物种间位置相似且侧翼序列差异显著的共有微卫星并非个例。4.基于基因组Survey数据的微卫星开发效率的评估本研究提取禾谷缢管蚜Rhopalosiphum padi基因组DNA,利用Illumina测序技术,获得了禾谷缢管蚜基因组Survey序列集,通过该序列集及随后公布的禾谷缢管蚜全基因组数据,对挖掘自Survey数据与全基因组数据的微卫星位点进行了比较,结果显示,在缺乏全基因组序列和足够的转录组数据的情况下,通过基因组Survey数据也能进行微卫星位点的开发。5.基于转录组数据的微卫星多态性信息分析新方法的开发及验证本研究首先开发了一种挖掘转录组微卫星的新软件PSSRdt(Polymorphic SSR digging tool,PSSRdt,已公布于https://github.com/PSSRdt/program),然后建立了一套完整的基于多转录组数据挖掘多态性微卫星位点的新方法,应用于微卫星鉴定与多态性信息获取的新软件PSSRdt是该方法中的核心。为了验证开发的新软件和分析方法,本研究对44个豌豆蚜转录组进行分析,筛选出1940个未经验证的多态性微卫星位点。为了验证这些微卫星位点的多态性,本研究设计微卫星引物,提取豌豆蚜样本DNA,分析其中52个微卫星分别在DNA样本中的多态性。结果显示,证明该方法能够高效准确的完成多态性微卫星位点的筛选。本研究为基于转录组数据开发多态性微卫星位点提供了新的方法,这为微卫星标记的相关研究奠定了良好的基础。6.基于基因表达谱分析豌豆蚜核心基因的特征、功能及核心基因的微卫星本研究对3种基因型的各5种蚜型的转录组进行分析,构建了基因表达谱,并对挖掘出的418个特异性表达基因进行了注释;提取豌豆蚜五种蚜型样本的RNA,通过q PCR对11个特异性表达基因进行验证,这些基因的相对表达水平与基因表达谱的表达水平趋势一致,证实了基因表达谱数据的准确性;构建了6种豌豆蚜基因表达的动态调控网络;鉴定得到263个核心基因和8个转录因子;从这些核心基因5’侧翼区中提取并鉴定得到223个微卫星位点并进行了分析,进一步筛选出能够用于豌豆蚜蚜型分析和鉴定的分子标记,这些由多种方法共同筛选出的分子标记,可能参与多种重要的信号通路(Pathway)。本研究对于利用分子标记深入分析蚜虫的非遗传多型性(Polyphenisms)具有重要的意义。