随着经济的进步，我国城乡工业不断发展，但是对劳动者的有效防护措施并没有得到顺利实施，因此在眼部整形手术中，继发于机械性、化学性、热损伤的眼睑缺损、眶周组织缺损等情况日益增多。它们不仅会引起眼闭合不全和眼表组织的暴露，还会因持续而难以矫正的干眼导致角膜上皮坏死、基质融解，进而引发角膜溃疡穿孔，甚至失明，使得大量劳动者因此而丧失劳动能力。同时，上述情况还严重影响了患者的外观，这在生活质量日益重要的今天，对于患者的心理乃至社会交往都形成了明显的阻碍。 少于三分之一长度的眼睑全层缺损可以通过直接缝合来修补，较大的缺损直接缝合相对困难，传统的手术方式多是利用正常眼睑组织或邻近组织进行修补，但是这些方法对组织损伤大，手术过程复杂。因此近年来采用眼睑缺损原位重建术(Eyelidreconstructioninprimaryposition)，用皮肤、睑板替代物和结膜替代物对眼睑的不同层次分别修复，既不破坏周围健康组织，又可以恢复较为满意的解剖结构和外观。在眼睑原位重建术中，睑板的重建是手术的关键，因为眼睑的外形和功能的完整性依赖于睑板的支撑，如果没有合适的睑板，眼睑修复后会因缺少具有一定硬度的支撑物而出现睑内翻、睑退缩，从而导致手术失败。理想的睑板替代物一方面应该与睑板有相似的厚度、硬度、弹性及光滑的基底面，另一方面应该具备易获取，术中操作简单，术后炎症反应轻等特性。 脱细胞组织基质(AcellularTissueMatrix，ACTM)是近年来生物衍生材料方面的研究热点。自从Meezan于1975年用化学除垢剂制作了一些组织的无细胞基底膜以来，现在脱细胞组织基质的制备多是以此基础发展而来：即用化学除垢剂联合其他辅助试剂脱去组织中的所有细胞、抗原、脂质、可溶性蛋白质等物质，保留具有完整外观形态和组织学及超微结构的不溶性基质成分，主要包括胶原、弹性蛋白、蛋白多糖、糖胺多糖和非胶原糖蛋白。因此，脱细胞组织基质不仅可以维持组织的正常构型，还可以为细胞再生提供支架，同时因为除去了引起免疫反应的细胞成分，因而避免了排斥反应的发生。目前，以脱细胞真皮为主的脱细胞组织基质已在眼科领域内得到广泛应用并收到良好效果。 硬脑膜和巩膜同真皮的构成类似，主要成分均是交织排列的胶原纤维，其中夹杂少量成纤维细胞、血管、内皮细胞等，是眼部整形常用的异体修复材料，国外的一些厂商曾将异体组织进行商品化生产，价格昂贵。但由于异体组织的抗原性强、容易传播疾病，故其应用受到限制。因此，本研究探索将硬脑膜和巩膜制备成脱细胞组织基质的方法，从形态学上观察其对睑板组织的重塑效果，从免疫学改变方面分析植入兔上睑后硬脑膜和巩膜抗原性的变化，为眼部修复手术寻找新的组织工程学材料。目前国内外尚未见使用脱细胞处理的硬脑膜、巩膜进行眼部修复的相关报道。 第一部分脱细胞组织的制备与鉴定 目的:以不同方法制备脱细胞硬脑膜和巩膜，比较不同方法、浓度、作用时间对硬脑膜和巩膜脱细胞效果的差异，找到适合硬脑膜和巩膜的脱细胞方法。 方法:将取自8只新西兰大白兔的硬脑膜和巩膜组织剪成小块，每种组织块均分为8组，每组含有硬脑膜和巩膜两种组织，4组用以0.5％、1％、2％、5％的TritonX-100为主，辅以DNase、RNase的方法处理，另外4组用0.25％胰蛋白酶和0.1％SDS分别处理12h+12h，12h+24h，24h+12h，24h+24h。完成后分别从大体观察8组的外观，HE染色比较脱细胞后的细胞残留数，透射电镜观察胶原纤维的超微结构。 结果:以TritonX-100处理后的组织外观与处理前相似，0.25％胰蛋白酶处理后的组织肿胀增厚。2％、5％TritonX-100两组和0.25％胰蛋白酶+0.1％SDS处理时间≥36h的三组组织内的细胞残留平均数都小于2个/高倍镜视野。电镜结果证实，硬脑膜和巩膜经过脱细胞处理后，胶原纤维结构同处理前相同，未受到破坏。 结论:以TritonX-100处理的硬脑膜和巩膜结构紧凑，胶原纤维保存完好，其中，2％TritonX-100浓度处理过的组织残留细胞少，处理前后外观改变少，是适合硬脑膜和巩膜进行脱细胞处理的方法。 第二部分脱细胞硬脑膜行眼睑修复的形态学及抗原性研究 目的:研究脱细胞硬脑膜植入新西兰大白兔上睑后的组织相容性，比较硬脑膜经脱细胞处理前后抗原性的变化。 方法:用2％TritonX-100辅以DNase、RNase制备兔脱细胞硬脑膜。将20只新西兰大白兔随机平均分为两组，每组10只，去除右上睑10mm×3mm的睑板后，分别植入兔交联型异体脱细胞硬脑膜和异体硬脑膜。于植入后1周、4周、8周取兔外周血，行IgG、IgA、IgM、C3、C4的定量测定；并用流式细胞仪检测CD4+T细胞、CD8+T细胞。于术后1周、4周、8周、12周取出植片，行免疫组织化学和HE染色检查。 结果:脱细胞硬脑膜植入上睑第1周，两组动物外周血中IgG分别是异体硬脑膜：0.095g/l，脱细胞硬脑膜：0.07g/l，p＜0.05，两组间有显著性差异；IgA、IgM、C3和C4的改变无明显差异。术后4周、8周，两组间IgG、IgA、IgM、C3、C4和CD4+T细胞、CD8+T细胞定量均无明显差异，p＞0.05。术后1周、4周、8周、12周，植入局部的光镜显示：脱细胞硬脑膜组的炎症反应和淋巴细胞浸润要小于异体硬脑膜组，成纤维细胞和新生血管长入情况相似，宿主成纤维细胞于术后8周基本完全长入植片。术后1、4、8周，CD4+T细胞计数显示：脱细胞硬脑膜组明显少于异体硬脑膜组，分别为5±2个、9±4个、11±3个；异体硬脑膜组分别为10±3个、31±4个、24±4个。CD8+T细胞计数：脱细胞组分别为：4±2个、8±2个、10±3个；异体硬脑膜组分别为10±3个、23±5个、22±5个。 结论:脱细胞硬脑膜植入眼部后显示出良好的组织相容性，可以有效地引导受体成纤维细胞和血管的长入，引起的炎症反应及淋巴细胞浸润较异体硬脑膜小，可以成为外眼组织修复手术中有应用价值的新型生物材料。 第三部分脱细胞巩膜行眼睑修复的形态学及抗原性研究 目的:研究脱细胞巩膜植入新西兰大白兔上睑后的组织相容性，比较巩膜经脱细胞处理前后抗原性的变化。 方法:用2％TritonX-100辅以DNase、RNase制备兔脱细胞巩膜。将20只新西兰大白兔随机平均分为两组，每组10只，去除右上睑10mm×3mm的睑板后，分别植入兔交联型异体脱细胞巩膜和异体巩膜。于植入后1周、4周、8周取兔外周血，行IgG、IgA、IgM、C3、C4的定量测定；并于术后4周、8周用流式细胞仪检测外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞。于术后1周、4周、8周、12周取出植片，行免疫组织化学和HE染色检查。 结果:脱细胞巩膜和异体巩膜植入上睑后第1周、4周、8周，两组间外周血IgG、IgA、IgM、C3、C4和CD4+T细胞、CD8+T细胞定量均无明显差异，p＞0.05。术后1周、4周、8周，植入局部的光镜显示：脱细胞巩膜组的炎症反应和淋巴细胞浸润要小于异体巩膜组，8周后植入的异体巩膜组织中央部发生少量坏死溶解现象，两组成纤维细胞和新生血管长入情况相似，于术后12周基本完全长入植片。术后1、4、8周，CD4+T细胞计数显示：脱细胞巩膜组明显少于异体巩膜组，分别为13±5个、26±11个、17±13个；异体巩膜组分别为25±7个、83±27个、69±24个。CD8+T细胞计数：脱细胞组分别为：7±4个、13±2个、7±3个；异体巩膜组分别为11±4个、28±9个、22±7个。 结论:脱细胞巩膜植入眼部后显示出良好的组织相容性，可以有效地引导受体成纤维细胞和血管的长入，引起的炎症反应及淋巴细胞浸润较异体巩膜小，可以成为应用于眼部修复手术的组织工程学材料。