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目的:Cereblon(CRBN)是广泛表达E3连接酶的蛋白,其介导来那度胺在骨髓瘤细胞发挥抗增殖活性,并诱导T细胞产生细胞因子。研究发现来那度胺的抗骨髓瘤活性需要Cereblon的表达,对CRBN蛋白功能有抑制作用,且CRBN是来那度胺治疗多发性骨髓瘤重要的分子靶点。本实验旨在研究免疫调节剂来那度胺及蛋白酶体抑制剂硼替佐米对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡及Cereblon表达水平的影响。1观察免疫调节剂来那度胺及蛋白酶体抑制剂硼替佐米抑制骨髓瘤细胞株RPMI8226增殖的作用。2检测免疫调节剂来那度胺及蛋白酶体抑制剂硼替佐米对骨髓瘤细胞株RPMI8226诱导凋亡的作用。3观察分析免疫调节剂来那度胺及蛋白酶体抑制剂硼替佐米对骨髓瘤细胞株RPMI8226Cereblon(CRBN)基因表达的影响。4观察分析免疫调节剂来那度胺及蛋白酶体抑制剂硼替佐米对骨髓瘤细胞株RPMI8226Cereblon(CRBN)蛋白表达的影响。方法:1首先选取人骨髓瘤细胞株RPMI8226为研究对象,用CCK8比色法检测来那度胺及硼替佐米对骨髓瘤细胞RPMI8226增殖的抑制作用。2应用流式细胞术检测来那度胺及硼替佐米诱导骨髓瘤细胞RPMI8226凋亡的作用;3应用实时荧光定量PCR方法检测来那度胺及硼替佐米对骨髓瘤细胞RPMI8226CRBN基因表达的影响。4应用Western Blot方法检测来那度胺及硼替佐米对骨髓瘤细胞RPMI8226CRBN蛋白表达的影响。5实验分组如下:(1)空白对照组:不加入任何药物,即来那度胺浓度为0nmol/L;(2)来那度胺干预组:预实验中分别以200nmol/L、800nmol/L、3200nmol/L浓度干预细胞24h、48h、72h,检测结果以干预24h后最理想,而干预48h,72h后细胞凋亡偏多,故下述实验均以干预24h为主,来检测来那度胺对RPMI8226细胞的增殖抑制作用。(3)硼替佐米干预组:以10nmol/L、20nmol/L、40nmol/L浓度分别干预细胞24h,来检测硼替佐米对RPMI8226细胞的增殖抑制作用。6实验分组如下:(1)空白对照组:不加入任何药物,即来那度胺浓度为0nmol/L;(2)来那度胺干预组:以200nmol/L、800nmol/L、3200nmol/L浓度的来那度胺分别干预细胞24h,来检测来那度胺对骨髓瘤细胞RPMI8226的促凋亡作用。(3)硼替佐米干预组:以10nmol/L、20nmol/L、40nmol/L浓度硼替佐米分别干预细胞24h,来检测硼替佐米对骨髓瘤细胞RPMI8226的促凋亡作用。7实时荧光定量PCR检测上述不同浓度来那度胺及硼替佐米对RPMI8226细胞的CRBN基因表达水平的影响。8Western Blot检测上述不同浓度来那度胺及硼替佐米对RPMI8226细胞的CRBN蛋白表达水平的影响。9应用SPSS13.0统计软件,方差分析方法处理数据。所有数据用3次独立实验的平均值表示,实验结果用均数±标准差(X±S)表示;P<0.05有统计学意义。结果:1来那度胺及硼替佐米作用于RPMI8226细胞均可以抑制其增殖。(1)分别以200nmol/L、800nmol/L、3200nmol/L浓度的来那度胺干预细胞24h;各组抑制率分别为(16.67±0.25)%、(26.35±1.21)%、(36.26±1.03)%,呈剂量依赖性,药物作用浓度越高,抑制率越高,抑制作用越明显,有统计学意义(P=0.00)(Fig.1,Table1)。(2)分别以10nmol/L、20nmol/L、40nmol/L浓度的硼替佐米干预细胞24h;各组抑制率分别为(8.13±1.14)%、(18.46±0.21)%、(31.43±1.64)%;呈剂量依赖性,药物作用浓度越高,抑制率越高,抑制作用越明显,有统计学意义(P=0.00)(Fig.2,Table2)。2来那度胺及硼替佐米对RPMI8226细胞的促凋亡作用。流式细胞术检测结果显示:(1)分别以0nmol/L、200nmol/L、800nmol/L、3200nmol/L来那度胺干预细胞24h,各组凋亡率分别为(7.12±0.59)%、(17.89±0.31)%、(29.4±0.71)%、(40.33±1.25)%,呈剂量依赖性,药物作用浓度越高,凋亡率越高,促凋亡作用越明显,有统计学意义(P=0.00)(Fig.3,Fig.5,Table3)。(2)分别以0nmol/L、10nmol/L、20nmol/L、40nmol/L硼替佐米干预细胞24h,各组凋亡率分别为(7.82±0.33)%、(14.26±0.60)%、(25.22±0.26)%、(34.54±1.24)%,呈剂量依赖性,药物作用浓度越高,凋亡率越高,促凋亡作用越明显,有统计学意义(P=0.00)(Fig.4,Fig.6,Table4)。3来那度胺及硼替佐米对CRBN基因表达的影响。实时荧光定量PCR结果显示:(1)分别以0nmol/L、200nmol/L、800nmol/L、3200nmol/L来那度胺干预细胞24h,CRBN基因的表达水平分别为1、0.81±0.02、0.52±0.01、0.23±0.02。试验中CRBN基因表达量呈剂量依赖性,随药物浓度的增加,表达量降低,有统计学意义(P=0.00)(Fig.7,Fig.8,Table5)。(2)分别以0nmol/L、10nmol/L、20nmol/L、40nmol/L硼替佐米干预细胞24h,CRBN基因的表达水平分别为1、0.39±0.03、0.17±0.02、0.09±0.02。试验中CRBN基因表达量呈剂量依赖性,随药物浓度的增加,表达量降低,有统计学意义(P=0.00)(Fig.9,Fig.10,Table6)。4来那度胺及硼替佐米对CRBN蛋白表达的影响。Western Blot结果显示:(1)分别以0nmol/L、200nmol/L、800nmol/L、3200nmol/L来那度胺干预细胞24h,CRBN蛋白的表达水平分别为1.48±0.03、1.14±0.01、0.95±0.01、0.56±0.02。试验中CRBN蛋白表达量呈剂量依赖性,随药物浓度的增加,表达量降低,有统计学意义(P=0.00)(Fig.11,Table7)。(2)分别以0nmol/L、10nmol/L、20nmol/L、40nmol/L硼替佐米干预细胞24h,CRBN蛋白的表达水平分别为1.39±0.1、1.32±0.1、1.36±0.2、1.34±0.2。试验结果表明硼替佐米对CRBN蛋白的表达无影响,无统计学意义(P=0.92)(Fig.12,Table8)。结论:1来那度胺对骨髓瘤细胞RPMI8226的抑制作用呈剂量依赖性,随药物浓度的升高,抑制率升高。硼替佐米对骨髓瘤细胞RPMI8226的抑制作用呈剂量依赖性,随药物浓度的升高,抑制率升高。2来那度胺对骨髓瘤细胞RPMI8226促凋亡作用呈剂量依赖性,随药物浓度的增高,凋亡率增高。硼替佐米对骨髓瘤细胞RPMI8226促凋亡作用呈剂量依赖性,随药物浓度的增高,凋亡率增高。3来那度胺对骨髓瘤细胞RPMI8226的CRBN基因的表达有抑制作用,呈剂量依赖性,随药物浓度的增高,表达量降低。硼替佐米对骨髓瘤细胞RPMI8226的CRBN基因的表达有抑制作用,呈剂量依赖性,随药物浓度的增高,表达量降低。4来那度胺对骨髓瘤细胞RPMI8226的CRBN蛋白的表达有抑制作用,呈剂量依赖性,随药物浓度的增高,表达量降低。硼替佐米对骨髓瘤细胞RPMI8226的CRBN蛋白的表达无影响。