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自身免疫性疾病是因机体免疫系统对自身成分发生免疫应答而导致相应组织器官甚至全身性的损伤以及功能障碍的一类疾病。对人类自身免疫病的认识常通过研究一些在临床症状和组织病理学方面存在很大相似性的动物模型来实现。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）即是一种在动物中枢神经系统（CNS）中出现的自身免疫性炎症和脱髓鞘病变，可分为主动性复发-缓解型EAE（REAE）和被动转移型EAE（tEAE），常作为人类多发性硬化（MS）的动物模型。 目前，针对自身免疫病的异常免疫应答，一般是不加区别地给予免疫抑制剂，而长期应用免疫抑制剂可导致免疫系统的广泛抑制、诱发感染和肿瘤，还不能有效地防止疾病的复发。基因治疗的出现和发展为现代治疗学开辟了一条新的途径。对EAE基因治疗的研究正方兴未艾，主要有两种途径，一是系统性基因治疗，将治疗性基因重组入病毒载体或质粒中，注入血液或转染致脑炎性自身反应性T细胞后回输体内。二是局部性基因治疗，利用病毒载体、质粒DNA或DNA-脂质体复合物将治疗性基因直接转移至CNS内。常用的病毒载体有逆转录病毒（RV）、腺病毒（Adv）、腺病毒相关病毒（AAV）、单纯疱疹病毒（HSV）等。 α-黑素细胞刺激素（α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH）具有明确的抑制炎症和免疫调节活性，还可以促进受损的外周神经或脊髓修复。我们以前的实验发现，经腹腔多次注射α-MSH，对EAE小鼠有较好的保护作用，其免疫学机制涉及抑制促炎性细胞因子的产生和增加抑炎性细胞因子的分泌。α-MSH是人体内存在的小分子调节肽，无抗原性，目前尚未发现有蓄积毒性。但是α-MSH半衰期较短、体内代谢较快，需要反复多次注射是其缺点。 基于α-MSH具有明确的抑制炎症作用和神经修复作用，以及rAAV对人无致病性，能感染分裂和非分裂细胞，目的基因与宿主细胞基因组整合使之能在体内长期稳定表达。而特异性自身反应性T细胞具有至炎症部位的归巢特性，且仅在受特异性自身抗原活化时才表达目的基因产物。故本研究以小鼠EAE为动物模型，用携带α-MSH基因的rAAV转染PLP139-151特异性T细胞。通过回输α-MSH基因修饰的特异性自身反应性T细胞（α-MSH-T细胞），研究对PLP139-151诱导小鼠EAE的治疗作用，并探讨相关的免疫学机制。 本研究的目的是探索人类CNS自身免疫性慢性炎症和脱髓鞘病变的有效基因第二军医大学博士论文中文摘要治疗手段，也为研究治疗其它自身免疫性疾病的措施提供一定的理论和实验依据研究分三个部分进行。 第一部分携带a一MSH基因的rAAVZ病毒的制备 将编码小鼠IL一6信号肤和a-MSH的基因序列定向克隆入含人源化重组绿色荧光蛋白（hrGFP）基因的表达载体pAAV.IRES一hrGFP，筛选到经酶切和测序确认正确的重组表达质粒pAAV.IL6sp一a一MSH一hrGFP后，用Qiagen去内毒素试剂盒提取和纯化。 将腺相关病毒重组系统（^AV Helper Free system）中的pHelper、pRC和PAAv‘IL6sP一a一MSH一hrGFP重组质粒或对照pAAV‘IRES.hrGFP质粒，采用磷酸钙转染法共转染HEK 293细胞，得到含有a一MSH基因的:AAV（a一MSH一rAAV2）和对照rAAV（hrGFP一rAAVZ）。初级病毒颗粒经氯仿一pEG8000/N aCI纯化后，再用Milipore超滤管Centroplus YM 100进一步浓缩。采用SDs-队GE蛋白电泳对rAAVZ病毒进行了初步鉴定。 用HRP标记的hrGFP基因为探针，点杂交病毒颗粒中的:AAVZ病毒基因组 （veetor genomes，v.g.），同pAAV.IREs一hrGFp标准质粒比较，计算纯化后rAAVZ的物理滴度为ZX10’3v.g./ml。将检测细胞HTlo80细胞株加入10倍梯度系列稀释的病毒液，培养40一48h，在荧光显微镜下计数某孔荧光细胞的数量ll（ 10<n<1 00），rAAv的感染滴度（tfu）一nX稀释倍数，测得rAAVZ的感染滴度为4 X10”tfu/ml，物理滴度/感染滴度的比值为50。 第二部分a-MSH基因修饰的PLP.Jg一:，，特异性T细胞 对EAE的治疗作用及其免疫学机制 本部分实验用a一MSH一rAAVZ转染PLP139一l。.特异性T淋巴细胞，制备出a一MSH基因修饰的PLP139一!5，特异性T细胞（a一MSH一T细胞）。然后将a一MSH一T细胞被动回输，观察其对EAE小鼠的治疗效果并探讨相关的免疫学机制。 取PLP139一，5!/C队免疫10天后S儿/J小鼠的引流淋巴结细胞，在体外经PLP，39一!5!刺激，再以lL一2扩增后获得PLP，39一!5!特异性T细胞（PLP!39一!5!一T细胞）。分别应用纯化并浓缩后的a一MSH·rAAVZ或hrGFP一rAAVZ转染PLP139.15，活化的PLP!39一!5一T细胞，制备出a-MSH一细胞和hrGFP一T细胞，通过荧光显微镜计数表达hrGFP的第二军医大学博士论文中文摘要细胞，计算出:AAVZ对活化性PLP:J（）、:5一T细胞的最适感染复数（MOI）为4x一。，v.g./ml、转染效率为22一250，0。 a一MSH一T细胞在体外受到PLP!3，一!5!刺激后，可呈时间依赖性地分泌a一MSH;细胞增殖能力下降，IL一2和IFN一Y的分泌减少，TGF一p的产生却明显增加（p<0 .01）;细胞表面CD25和CD28分子的表达减少，而CD3和MHCll类分子的表达无明显变化;整个细胞群体中CD矿cD25+调节性T细胞（Treg cells）所占的比例?