随着人们生活方式的变化和环境污染，过敏性疾病的发病率不断上升。过敏性疾病不仅危害人们的健康，而且给家庭和社会造成巨大的经济负担。螨类引起的过敏反应是人类最常见的变态反应。尘螨是20世纪60年代发现的一种最强烈的变应原，也是室内变应原中最主要的成分，多数哮喘、过敏性鼻炎及过敏性湿疹与尘螨有关，严重影响人体健康，但目前仍没有理想的检测试剂及治疗方法。我国在该类疾病的诊治中所用的大多数是螨浸液，其中存在各种难以标化的变应原性和非变应原性成分，在免疫治疗过程中容易产生各种意想不到的副作用，如在治疗过程中出现严重的过敏反应，不可逆的气道痉挛等，而且变应原的来源不易，制备蛋白质提取纯化工艺要求较高，蛋白质标准化较困难等问题。因此，螨浸液用于螨类变态反应疾病的诊治存在很多不足。研制安全高效新型变应原疫苗具有重要意义。 研究目的 鉴于直接从粉尘螨中分离纯化粉尘螨Ⅱ类、Ⅴ类主要变应原难度较大，本研究采用基因克隆和重组表达技术，获得广州地区粉尘螨Ⅱ类、Ⅴ类变应原的全长基因，构建Derf2、Derf5基因原核表达系统进行蛋白表达，以期获得重组蛋白的高效表达，为进一步开发国产尘螨变应性疾病诊断试剂盒打下基础，为螨类变态反应疾病的免疫治疗提供高纯度、易于标准化的重组变应原蛋白。研究方法提取广州地区粉尘螨总RNA，并根据已知的粉尘螨Ⅱ类、Ⅴ类变应原基因完整序列设计特异性引物，逆转录为cDNA，以cDNA为模板PCR扩增两条基因，并进行TA．克隆获得粉尘螨Ⅱ类、Ⅴ类变应原基因。 将粉尘螨Ⅱ类、Ⅴ类变应原基因分别定向克隆至原核表达载体P、P，构建P-Derf2、P-Derf5原核表达质粒；转化入大肠杆菌BL21，进行IPTG诱导表达，表达产物进行SDS-PAGE和Western-bloting分析鉴定。 纯化粉尘螨Ⅴ类变应原蛋白，免疫大鼠，5周后获得多克隆抗体血清；利用ELISA分别检测大鼠血清、病人血清及正常人血清，了解该蛋白的诊断价值及免疫学功能；并对粉尘螨Ⅴ类变应原进行组织化学定位。 研究结果 1．构建Derf2、Derf5基因克隆菌株并进行序列测定构建的T-Derf2/JM109、T-Derf5/JM109克隆菌株，经PCR鉴定、酶切鉴定、测序结果分析表明，克隆获得广州地区粉尘螨Derf2、Derf5全长基因。两者分别与GenBank中日本来源的Derf2、Derf5基因同源性为99﹪，推导氨基酸序列同源性也为99﹪。 2．构建表达载体并实现了目的蛋白的体外表达构建的p-Derf2、p-Derf5表达质粒，经转化获得可表达目的蛋白质的大肠杆菌工程菌株p-Derf2/BL21、P-Derf5/BL21，经SDS-PAGE分析显示目的条带大小，与理论值相符；经Western-bloting分析目的蛋白可分别被抗GST抗体、抗HIS抗体识别。 3．重组蛋白的纯化和动物免疫重组蛋白P-Derf5/BL21经HIS标签结合柱纯化，鉴定为目的蛋白，ELISA分析目的蛋白免疫诊断价值；分别被豚鼠抗粉尘螨血清，人抗尘螨血清识别，正常人群有一定的假阳性率；利用获得纯化蛋白免疫大鼠，5周后ELISA检测血清成强阳性，效价达1：24,000。 4．粉尘螨Ⅴ类变应原组织化学定位组织定位结果表明粉尘螨Ⅴ类变应原主要是消化道内容物。 结论 1．获取广州地区粉尘螨Ⅱ类、Ⅴ类变应原全长基因，并成功构建克隆菌株T-Derf2/JM109、T-Derf5/JM109，并对序列进行生物信息学分析。 2．成功构建P-Derf2、P-Derf5表达质粒，并在大肠杆菌中表达重组蛋白质。 3．获得并鉴定Derf2重组蛋白，纯化粉尘螨Derf5重组蛋白，并成功免疫大鼠；获得的蛋白与大鼠血清、豚鼠抗粉尘螨血清和螨肺病人血清反应有较高的敏感性。 4．免疫组织化学定位显示粉尘螨Derf5便应原集中存在其消化道内。