论文部分内容阅读
目的:为了研究类风湿关节炎（RA）患者对环瓜氨酸肽（CCP）的体液免疫反应和细胞免疫反应,分别采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测患者血清中抗CCP抗体,采用酶联免疫斑点试验（ELIspot）与MHC肽四聚体（tetramer）流式细胞术检测患者外周血单个核细胞（PBMC）中对CCP抗原特异的自身反应T细胞（CCP-ART细胞）,观察所测抗CCP抗体、CCP-ART细胞与RA患者临床症状及常用血清学指标的相关性,分析两者对RA的诊断与病情判断价值。方法:采用链霉亲合素（SA）预包被反应板,使生物素化CCP（bio-CCP）与之结合并固相化,建立检测抗CCP抗体的间接ELISA法,并进行方法学考核和临床病例检测;采用ELIspot研究RA患者的CCP-ART细胞（在CCP作用下特异性分泌IFN-γ和IL-4的的斑点形成细胞）阳性率;用MHC肽四聚体流式细胞术研究CD4+CD8-CCP-四聚体阳性细胞（以其作为CCP-ART细胞）。对检测抗CCP抗体的ELISA法与检测CCP-ART细胞的ELIspot和MHC肽四聚体流式细胞术对RA的诊断价值以及与临床症状和相关血清学指标的关系进行分析和临床应用评价。结果:用链霉亲合素-生物素化CCP预包被的ELISA检测抗CCP抗体对RA的诊断敏感性为69.4%,特异性为96.8%,阳性预测值为89.1%,阴性预测值为94.1%,阳性似然比为19.28,阴性似然比为0.317,Youden指数为0.658。与德国欧蒙公司试剂比较,两法所测抗CCP抗体水平以吸光度/cut-off值的比值表示显著相关（n=61,r=0.92531,P＜0.001）。在所统计的168例血清样本中,两法同时阳性者60例,同时阴性者105例,总符合率达98.2%,结果具有高度一致性（Kappa=0.961,P＜0.001）。ROC曲线分析结果显示,本法所测抗CCP抗体对RA诊断准确性达到较高水平,曲线下面积(AUCROC)达0.901。在13例诊断为早期RA患者中,有10例抗CCP抗体阳性（阳性率76.9%）,未发现抗CCP抗体与RA患者临床症状、疾病活动指标血沉（ESR）,C反应蛋白（CRP）及类风湿因子（RF）水平有关。ELIspot研究结果表明,RA患者的PBMC经CCP抗原刺激后分泌IFN-γ和IL-4的SFC数分别为236.8±40.4和11.8±1.8,两种SFC数的比值为25.8±5.6,结果均显著高于其它自身免疫性疾病和健康人对照组（P＜0.05）。抗CCP抗体阳性患者的PBMC经CCP作用后分泌IFN-γ的SFC数显著高于抗CCP抗体阴性患者（SFC数分别为288.3±54.8和151.5±3 1.3）,抗CCP抗体阴性的RA患者又显著高于健康人对照（20.8±8.7）。（P均＜0.05）。特异性分泌细胞因子（IFN-γ和IL-4）的SFC数均与抗CCP抗体吸光度（A）显著相关,相关系数（r）分别为0.318和0.322（P＜0.05）。分沁IFN-γ和IL-4的特异性SFC数之和与RA患者关节外症状出现比例,抗核抗体（ANA）滴度,CRP及ESR水平均未发现有明确的相关关系,但与RF水平显著相关,r=0.563（P＜0.05）。ROC曲线分析结果显示,分沁IFN-γ与IL-4的SFC比值及特异性分泌IFN-γ的SFC数对RA具有潜在的诊断和应用价值(其AUCROC值分别为0.911和0.864)。以15.1为cut-off值,在32例RA患者中,共发现有20例（62.5%）CCP-ART细胞阳性,抗CCP抗体阳性19例（59.4%）,CCP-ART细胞与抗CCP抗体中有1项或1项以上阳性者26例（81.3%）。优化并确定了检测CCP-ART细胞的MHC肽四聚体流式细胞术的最佳实验条件,并以CD4+CD8-CCP-四聚体阳性细胞作为CCP-ART细胞。结果发现RA患者CCP-ART阳性率（1.03±0.76）%,显著高于SLE组和健康人对照组（P＜0.05）;抗CCP抗体阳性组CCP-ART阳性率（1.24±0.82）%,显著高于抗CCP抗体阴性组（0.71±0.53）%,抗CCP抗体阴性组又显著高于健康人对照组（P＜0.05）。CD4+CD8-CCP-四聚体阳性细胞数与ELIspot所测特异性分泌IFN-γ与IL-4的SFC数之和具有较好的一致性,并与抗CCP抗体水平显著相关,r=0.350（P＜0.05）,但未发现与其它实验指标（包括ANA滴度,CRP及ESR水平）有明确的相关关系。临床研究结果发现,RA患者关节外症状出现比例、肿痛关节数及破坏关节数有随CD4+CD8-CCP-四聚体阳性细胞检出结果升高的趋势,但无统计学差异。在所研究病例中发现有31.4%的RF阴性患者此类CCP-ART细胞水平升高。对2例RA患者动态观察发现,CD4+CD8-CCP-四聚体阳性细胞数与患者的临床症状及RF水平变化相同步。ROC曲线分析其对RA疾病的AUCROC值为0.824,显示此类CCP-ART细胞数的升高对RA亦具有潜在的诊断和应用价值。结论:成功建立链霉亲合素-生物素化CCP预包被的检测抗CCP抗体的ELISA系统,方法敏感、特异、可靠,可用于RA的常规实验室诊断。开发后可制成价廉的试剂盒,取代进口试剂。以CCP抗原刺激PBMC,用ELIspot和MHC肽四聚体流式细胞术两种方法检测对CCP特异的ART细胞。研究发现,RA患者体内存在CCP抗原特异性Th1/Th2失衡,并呈CCP特异性Th1优势状态。RA患者的CCP-ART细胞阳性率显著高于其它自身免疫性疾病患者和健康人对照者,并与其RF和抗CCP抗体水平显著相关,具有潜在的诊断和应用价值,特别是对于RF阴性的RA患者更具有意义。联合检测CCP-ART细胞与抗CCP抗体可有效提高对RA的诊断水平,并可对疾病状态作出合理评估。