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杆菌肽(bacitracin)是一种12个氨基酸残基组成的多肽类抗生素,可有效抑制革兰氏阳性病原菌和部分革兰氏阴性菌,其主要生产菌株为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)和枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。目前,杆菌肽是国内外销售量最多、广泛应用于饲料中的一种新型的理想抗生素。本研究以一株产杆菌肽地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis DW2为出发菌株,通过物理和化学方法诱变筛选高产杆菌肽的突变株,并运用分子生物学的理论和基因工程的方法构建含有vgb基因的穿梭表达载体的地衣芽胞杆菌工程菌,同时建立一种基于杆菌肽抑菌活性的96微孔板检测方法。主要研究结果如下：(1)通过理化方法诱变筛选高产杆菌肽突变株：以B.licheniformis DW2为出发菌株,经紫外线(UV)和硫酸二乙酯(DES)复合诱变,结合琼脂柱扩散法,对杆菌肽抗性平板中的大量存活菌进行初筛,得到659株诱变菌株,经摇瓶发酵复筛,得到4株突变株,与出发菌株相比,杆菌肽产量的最大提高量仅为1.4%。(2)构建表达vgb基因的地衣芽胞杆菌工程菌：构建pHY300-vgb,电转将pHY300-vgb和pHY300导入B.licheniformis DW2中,分别得到B.licheniformis (pHY300-vgb)和B.licheniformis (pHY300),验证表明两质粒转化成功；经CO差光光谱分析表明,B.licheniformis (pHY300-vgb)中VHb有表达活性；摇瓶发酵实验结果显示,500 mL三角瓶装液量150 mL时,尽管B.licheniformis(pHY300)和B.licheniformis (pHY300-vgb)的发酵液抑菌圈均小于DW2发酵液的抑菌圈,但B.licheniformis (pHY300-vgb)与B.licheniformis (pHY300)相比,杆菌肽产量提高15.46%；3 L发酵罐分批发酵中,虽然B.licheniformisDW2的生物量和发酵液效价均高于B.licheniformis (pHY300)和B.licheniformis (pHY300-vgb),但B.licheniformis (pHY300-vgb)单位菌体杆菌肽产量较B.licheniformis DW2提高9.47%,生物量和发酵液杆菌肽效价比B. licheniformis (pHY300)的分别提高23.31%,42.55%。(3)建立利用96微孔板对杆菌肽效价的生物测定方法：实验表明,指示菌为藤黄微球菌,选择对数生长初期,初始OD600=0.2,37℃,800r/min,振荡培养6 h,在杆菌肽效价0.01 U/mL～0.04 U/mL范围内测定,重复性和稳定性良好。