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目的目前关于放射治疗效应机制的最新研究表明：辐射所致细胞死亡的主要形式是细胞凋亡，研究辐射对肿瘤细胞凋亡的诱导及基因调控具有重要意义。细胞凋亡（apoptosis，APO）或细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）是近年来肿瘤学领域里的研究热点之一，它不仅参与肿瘤的发生、发展和转归，而且与肿瘤的治疗及治疗效果也密切相关。如能诱导肿瘤细胞凋亡，使其凋亡率增加，则可能遏止肿瘤的发生、发展。本实验研究电离辐射对喉癌Hep-2细胞株凋亡率的影响，并探讨其作用的量效关系及对细胞周期的调控，同时研究凋亡相关基因的表达变化。材料与方法1．用含10％FBS的RPMI 1640培养基体外培养Hep-2细胞株，接种指数生长期细胞，培养24小时后接受x线照射。分别采用0Gy（对照组）、2．5Gy、5Gy、7.5Gy、10Gy和15Gy的X射线辐射Hep-2细胞株。在光镜、电镜下分别观察细胞形态学变化。2．应用Annexin V／PI双标法，流式细胞仪检测不同剂量辐射处理后的Hep-2细胞的凋亡率和坏死率的变化。3．采用Nicoletti等的方法，收集不同辐射、剂量的全部悬浮和贴壁细胞。经流式细胞仪检测DNA含量，并进行细胞周期分析。4．免疫组织化学染色法检测各基因的蛋白质表达情况。以接受10Gy辐射的细胞为实验组，未接受辐射的细胞为对照组。辐射后12小时、24小时、48小时和72小时分别取出生长有细胞的盖玻片进行免疫细胞化学染色，观察辐射前后各相关蛋白质阳性细胞百分比的变化。5．免疫蛋白印迹杂交（Western blot）检测辐射前后凋亡相关基因蛋白（BCL-2、BAX、C-MYC、P15、P16、P21、P27、P53）表达水平的变化。6．采用半定量RT-PCR检测辐射前后癌基因和抑癌基因（BCL-2、BAX、C-MYC、P15、P16、P21、P27、P53）mRNA表达水平的改变。7．统计学分析各组数值采用SPSS软件进行分析，组间差别采用t检验。结果1．透射电镜下观察辐射处理后的Hep-2细胞系，可见细胞染色质固缩，聚集于核膜下，呈新月状和花瓣状，可见核碎片；内质网增生，细胞胞浆内出现大量空泡，凋亡小体形成。2．同一剂量照射后，随着时间的延长，细胞凋亡率呈现增加的趋势，至48小时达高峰；48小时后，细胞凋亡率反而下降。在辐射作用后的相同时间，随着剂量的增加，凋亡率也升高，至剂量为10Gy时达到高峰；剂量超过10Gy后，凋亡率明显下降。3．同一剂量照射后，随着时间的延长，细胞坏死率呈现增加的趋势，至72小时达高峰。低剂量辐射时，随时间的延长，细胞坏死率略有增加；当高剂量辐射（15Gy）时，随时间的延长，细胞坏死率明显增加。4．经流式细胞仪分析表明，对照组中，大多数细胞处于G1／G0期，只有14.13％的细胞处于G2／M期，27.45％的细胞处于S期。低剂量（2.5Gy）辐射组中，多数细胞处于G2／M期，而G1／G0和S期细胞明显减少，说明低剂量辐射后的细胞产生了G2／M期阻滞；高剂量（10Gy）辐射组中，处于G1／G0期的细胞明显增加，而处于S期和G2／M期的细胞减少，说明高剂量辐射后的细胞产生了G1期阻滞。5．免疫组织化学染色表明，对照组和实验组BCL-2、BAX和C-MYC阳性率分别为48.6％和23.1％，53.3％和65.1％，42.7％和21.9％，其中BCL-2和C-MYC阳性率降低，差异有显著性（P＜0.05）。对照组和实验组P15、P16、P21、F27和突变型P53阳性率分别为38.2％和51.4％，25.3％和39.7％，15.4％和24.8％，17.8％和28.3％，71.3％和63.2％。辐射后，P15、P16、P21、P27蛋白阳性率增加，与对照组相比差异有显著性（P＜0.05）。突变型P53阳性率略有降低，与对照组相比差异无显著性（P＞0.05）。对照组和实验组BCL-2／BAX的比值分别为0.91和0.35，差异有显著性（P＜0.01）。6．免疫蛋白印迹杂交（Western blot）检测表明，辐射后BCL-2、C-MYC和突变型P53蛋白表达下调，而P15、P16、P21和P27蛋白表达上调。7．半定量RT-PCR方法检测相关癌基因转录水平的变化，结果表明，辐射后BCL-2、BAX、C-MYC和突变型P53 mRNA表达下调，而P15、P16、P21和P27 mRNA表达上调。结论1．电离辐射可以诱导人喉癌Hep-2细胞株发生凋亡，且不同剂量的电离辐射可使细胞阻滞于G2／M期或G1期。2．BCL-2、BAX、C-Myc及P15、P16、P21和P27参与了电离辐射诱导的Hep-2细胞凋亡过程。3．电离辐射可能经非P53依赖途径诱导喉癌细胞发生凋亡。