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木聚糖是大量存在于植物细胞壁中的半纤维素成分,也是自然界中五碳糖的主要来源,在生物炼制转化能源和化学品方面具有巨大的开发价值。乙偶姻是一种重要的平台化合物和多功能材料,被广泛应用于食品、化工、医药、烟草等行业。本文首先对能够直接利用天然生物质的极端嗜热厌氧细菌Caldicellulosiruptor/aactoaceticus 6A(C.lac)降解木聚糖的酶解模式进行了解析,构建了体外天然木聚糖高温酶解体系;同时选育了能够同时利用五(六)碳糖合成乙偶姻的耐高温枯草芽孢杆菌,实现了从天然生物质到乙偶姻的高温同步糖化发酵转化;此外,以五(六)碳糖代谢过程和重组酶为基础,体外构建了从五(六)碳糖到乙偶姻的非细胞酶促合成体系。研究成果包括以下3个部分:1.解析了极端嗜热菌C lac对天然木聚糖的高温酶解模式:(1)胞内高温协同酶解体系的表征和构建:从Cl.基因组中分别克隆、异源表达和表征了胞内木聚糖降解酶系(GH10家族β-1,4-内切木聚糖酶Xyn1OA、GH51家族α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51A和GH67家族α-葡萄糖醛酸苷酶Agu67A),该酶系在75-80℃、pH 5.5-6.5条件下能够协同酶解天然木聚糖:Xyn1OA能降解木聚糖主链,Abf51A和Agu67A能分别移除木聚糖侧链上的阿拉伯糖基和4-0-甲基-葡萄糖醛酸基团。(2)胞外多结构域β-1,4-内切木聚糖酶分子机理解析:C.lac胞外GH10家族β-1,4-内切木聚糖酶Xyn1OB具有特异的CBM22/GH10/CBM9/SLH多结构域结构,其装配有不同结构域模块的重组酶在热稳定性、底物特异性和水解效率等方面有很大的差异。CBM22特别是CBM22c能够增强重组酶的热稳定性和催化活性,但这种正效应随着CBM9的存在而减弱。2.选育了可同时利用五碳糖和六碳糖的耐高温乙偶姻高产枯草芽孢杆菌,实现了从生物质到乙偶姻高温同步糖化发酵转化:(1)菌种选育和发酵过程优化:利用菌种筛选和复合诱变选育获得耐高温的乙偶姻高产突变菌株BacilussubtilisIPE5-4-UD-4;通过培养基组分和发酵条件的单因素及正交优化,以葡萄糖为底物,其37℃下摇瓶发酵乙偶姻最高产量达到26.09 ± 1.01 g/L;补料分批发酵时,以8 g/h的流加速度补料400 g葡萄糖,最终发酵60 h时乙偶姻浓度最高产量达到48.09 ± 0.63 g/L。(2)复合诱变菌株高温发酵单糖的研究:利用其静息细胞于50℃下催化10 mMD-葡萄糖反应24 h,最高可产生2.70 ±0.02 mM乙偶姻。以葡萄糖和木糖的混合糖为底物,于50℃下摇瓶发酵72 h后乙偶姻最高产量达到17.78 ± 0.19 g/L,产率为0.38g/g混合糖,生产速率为0.25g/L/h。以葡萄糖为底物,于50℃下发酵罐分批发酵48 h后,乙偶姻最高产量达到28.83 ± 0.65 g/L,产率为0.34 g/g葡萄糖,生产速率为0.60g/L/h。(3)高温同步糖化发酵碱处理玉米芯生产乙偶姻工艺的建立:以碱处理玉米芯为底物,利用商业纤维素酶-木聚糖高温酶系和耐高温菌株B.subtilis IPE5-4-UD-4,构建乙偶姻高温同步糖化发酵过程。于最优温度50℃下摇瓶同步糖化发酵72 h后,乙偶姻最高产量达到12.55 ± 0.28 g/L,产率为0.25 g/g底物,生产速率为0.17 g/L/h。同时原料中纤维素和半纤维素转化率的最高值分别达到96.34%和93.29%。进一步于50℃下发酵罐分批同步糖化发酵60 h后,乙偶姻最高产量达到22.76 ±1.16 g/L,产率为0.46 g/g底物,生产速率为0.38 g/L/h,这是迄今为止以同步糖化发酵方式转化木质纤维素生物质获得的最高乙偶姻生产强度。3.以微生物D-木糖和D-葡萄糖代谢为基础,从高温合成和常温合成的角度,解析了乙偶姻及其手性异构体(R)-乙偶姻的酶促合成过程,构建了人工体外无细胞酶促合成途径。(1)由丙酮酸高温无细胞酶促合成乙偶姻:基于丙酮酸代谢途径,以丙酮酸为底物,构建了一条包括两步连续反应的乙偶姻高温体外酶促合成途径。该途径包括2个高温重组催化酶,反应不需要ATP和辅酶I。从高温菌Caldicellulosiruuptor owensensis OL 和 B.sublis IPE5-4 基因组中分别成功克隆、异源表达和表征了高温催化酶。在65℃、pH 6.5的最佳反应条件下,用1 U混合酶(coAHASLl/bsALDC4:1,U/U)催化10mM丙酮酸体外反应24h可生成3.36±0.26mM乙偶姻,其生产速率达到0.14mM/h,产率为33.92%,为理论产率的 67.80%。(2)由D-木糖高选择性无细胞酶促合成(R)-乙偶姻:基于D-木糖代谢的Dahms途径,以D-木糖为底物,构建了一条高选择性无细胞酶促合成(R)-乙偶姻的途径。该途径包括7个重组催化酶,反应不需要ATP,且可以实现辅酶NAD+再生。从Escherichiia coli W3110、B.subtilis shaijiu32 和 Caulobactercrescentus CB 2基因组中成功克隆、异源表达和纯化了所有重组催化酶。每步酶添加1 U,在30℃、pH 7.5的最佳反应条件下,催化10 mM D-木糖反应24 h可获得3.17 ± 0.06 mM(R)-乙偶姻,其对映体过量值达到99.07%,生产速率为0.13 mM/h,产率为18.75%,达到理论产率的63.89%。(3)由D-葡萄糖高温无细胞酶促合成乙偶姻探索:基于D-葡萄糖代谢的糖酵解途径,以D-葡萄糖为底物,构建了多酶高温催化合成乙偶姻途径。该途径共需要13个催化酶,能实现辅酶NAD+偶联再生。从高温菌C.owensensisOL、Thermobifida fuusca DSM 43792和B.subti is IPE5-4基因组中成功克隆、表达和纯化了相关高温催化酶。以D-葡萄糖或果糖-1,6-二磷酸为底物,利用由重组酶组成的无细胞酶促体系于50℃下催化可检测到乙偶姻生成。利用诱变菌IPE5-4-UD-4静息细胞的粗酶液以及粗酶上清催化液,于50℃下可转化葡萄糖生成乙偶姻,以粗酶液催化10 mM D-葡萄糖反应24 h最高可产生2.65 ± 0.59 mM乙偶姻。