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本课题在“抗原定向选择法”人源化鼠单抗的基础上探讨了一种新的人源化技术路线——CDR3导向抗体库技术,对抗膀胱癌单抗BDI进行人源化。 首先通过RT-PCR方法从分泌抗膀胱癌单抗的杂交瘤细胞BDI中扩增鼠k链、Fd段基因,DNA序列测定表明分别属于MκⅣ和MH3D亚群。将k链和Fd段基因克隆到噬菌体表达载体p3MH中,在大肠杆菌中获得表达。通过PCR介导的定点突变,将Fd段N端的氨基酸序列矫正为亲本鼠的原始序列,提高Fab的结合活性。运用ELISA、竞争抑制实验、免疫组化实验证实所获Fab为BDI的Fab。 然后根据鼠单抗序列合成含鼠CDR3区的寡核苷酸引物,通过重叠PCR及DNA重组技术,将抗膀胱癌鼠单抗BDI的CDR3区与人淋巴细胞来源的多样化的VH和VL组合,构建含BDI CDR3的初级人源噬菌体抗体库,库容为2×107;利用loxp-cre定位重组系统,经过在cre+ BS1365细菌胞内的定位重组后,增加轻重链的组合配对,最终获得容量为1×1010大容量次级噬菌体抗体库。用膀胱癌细胞(EJ)进行四轮的吸附-洗脱-扩增,挑选第四轮筛选后的46个克隆进行ELISA检测,获得4个能够与EJ细胞特异结合的克隆。竞争抑制实验显示,其中3个与亲本鼠单抗识别相同的抗原表位。测定其可变区基因的序列,VH分别属VHⅠ、VHⅡ亚群,Vk属VkⅠ、VkⅥ亚群。选择活性较高的克隆进行膀胱癌组织的免疫组化实验,显示该克隆能够与癌组织特异性结合。 本研究通过鼠CDR3对人抗体库的限定,使所获抗体库具有预定的偏向性,有利于特定抗体的筛选。同时将loxp-cre重组系统引入噬菌体抗体库中,构建大容量抗体库。不用鼠单抗做模板进行链替换,获得了与鼠单抗识别相同表位的人源抗体。