论文部分内容阅读
目的:神经炎症是脑缺血、阿尔茨海默病等急、慢性神经系统疾病中常见的一种病理特征。在大脑受到微生物感染或各种不良刺激时,小胶质细胞活化并产生大量的炎症因子。磷酸二酯酶4(phosphodiesterase 4,PDE4)在小胶质细胞高度表达。抑制小胶质细胞中PDE4的活性,可通过减少炎症因子的转录及剪切成熟而发挥抗神经炎症的作用。但PDE4抑制剂能否直接对抗炎症因子引起的神经元损伤,还研究较少,其机制也还不清楚。FCPR16是本实验室合成的新型PDE4抑制剂,对PDE4D亚型具有较高的选择性。我们前期的研究显示:在抑郁症模型中FCPR16可减少M1型小胶质细胞的比例,从而减少炎症因子的产生。但FCPR16能否对抗炎症因子诱导的神经元损伤还不清楚。传统的炎症模型多采用细菌细胞壁成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)来构建。鉴于神经系统疾病的炎症大多是无菌性炎症,以炎症因子大量增加为特征。因此,本项目拟直接采用与临床实际情况更接近的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)来诱导神经元损伤。我们以HT-22海马神经元细胞系为研究对象,用TNF-α建立神经损伤模型,探索FCPR16能否对抗TNF-α诱导的神经损伤及其可能的作用机制。方法:(1)不同浓度TNF-α(0.1-100 ng·mL-1)处理HT-22细胞24 h,获得TNF-α损伤细胞的量效关系,建立神经损伤模型。在其基础上给予不同浓度的FCPR16(1.5-100 μM)预处理1 h,采用CCK-8法检测细胞存活力,考察FCPR16能否对抗TNF-α引起的细胞损伤。(2)采用流式细胞术检测细胞的凋亡比例;采用Hoechst染色检测HT-22细胞核形态变化;采用PI染色检测细胞死亡率;采用Western blot检测凋亡相关蛋白的表达。通过以上指标考察FCPR16能否对抗TNF-α引起的细胞凋亡。(3)通过转染PDE4B siRNA(siPDE4B)来进一步验证PDE4B在敲低条件下对神经元细胞的作用。利用Lippofectamine 2000在HT-22细胞内转染siPDE4B(100 nM)并给予 TNF-α(1.5 ng·mL-1)处理;采用 Western blot 检测凋亡相关蛋白的表达水平,采用PI染色检测siPDE4B对HT-22细胞死亡率的影响。(4)用 1.5 ng·mL-1 TNF-α 处理 HT-22 细胞不同时间(1-12 h),获得 TNF-α影响细胞突触相关蛋白表达的时效关系。在其基础上给予FCPR16(50 μM)预处理 1 h,采用 Western blot 检测 FCPR16 对生长相关蛋白-43(growth associated protein-43,GAP-43)、突触蛋白1(Synapsin 1)及脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)表达水平的影响。通过以上指标评价FCPR16对HT-22细胞突触相关蛋白表达的影响。(5)FCPR16作用的信号通路研究:①采用Western blot检测FCPR16对HT-22细胞内c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-termminal kinase,JNK)磷酸化水平的影响。②给予FCPR16以及JNK抑制剂SP600125(1 μM)预处理1 h后,TNF-α(1.5 ng·mL-1)刺激 12 h,采用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒检测细胞毒性,采用Western blot检测JNK抑制剂对细胞凋亡相关蛋白表达的影响。③采用Western blot和免疫荧光染色检测FCPR16对核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)核转位的影响。④采用Western blot检测一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的表达水平,利用活性氧染色试剂盒检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生水平,用ELISA试剂盒检测3-三硝基酪氨酸(3-Nitrotyrosine,3-NT)水平,采用丙二醛(malondialdehyde,MDA)检测试剂盒测定MDA水平。⑤分别采用Western blot及免疫荧光染色检测内质网应激相关蛋白的表达。结果:(1)不同浓度(0.1-100ng·mL-1)TNF-α处理HT-22细胞24h,可剂量依赖性地降低细胞活力,在1.5 ng·mL-1浓度时,细胞存活率为50-60%;而FCPR16则呈浓度依赖性地增加HT-22细胞的活力。(2)在TNF-α建立的HT-22细胞神经损伤模型中,FCPR16能显著降低细胞早期及晚期细胞的凋亡率、改善细胞核形态并显著下调Cleaved caspase 3和Cleaved caspase 8 的表达水平。(3)在TNF-α引起的神经炎症条件下,敲减PDE4B显著降低HT-22细胞Cleaved caspase 3 及 Cleaved caspase 8 的水平及 PI 阳性细胞数。(4)1.5 ng·mL-1 TNF-α处理HT-22细胞后,TNF-α呈时间依赖性地降低突触相关蛋白GAP-43及Synapsin 1的表达,而给予FCPR16后,突触相关蛋白GAP-43、Synapsin 1及BDNF表达水平显著上升。(5)与TNF-α模型组相比,FCPR16显著降低JNK的磷酸化水平,而对总JNK的蛋白表达没有显著影响,JNK抑制剂SP600125显著降低LDH的释放水平,降低Cleaved caspase 3的表达。在TNF-α处理后,核NF-κB p65表达显著增加,而FCPR16显著降低核内NF-κB p65表达水平。我们同时发现FCPR16能显著降低iNOS表达水平、减少ROS的产生并降低3-NT和MDA水平。(6)TNF-α对内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated p rotein78 kD,GRP78)及真核起始因子 2α(eukaryotic initiation factor 2α,eIF2α)的磷酸化水平没有影响,也未观察到FCPR16对eIF2α磷酸化水平的影响。结论:PDE4抑制剂FCPR16能拮抗TNF-α引起的HT-22神经细胞损伤,其机制可能是FCPR16阻断了 TNF-α对JNK和NF-κB/iNOS信号通路的激活,从而减少活性氧的产生,降低神经元细胞凋亡率,并减轻突触损伤。