脂质体介导99Tcm-EGFRmRNA反应肽核酸肿瘤显像的实验研究

来源 :河北医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wanfl1985
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目的:研究脂质体介导放射性核素99Tcm标记的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)mRNA反义肽核酸(peptidenucleic acid,PNA)的方法,测定该反义分子探针的标记率,评价其体内外稳定性,并探讨脂质体介导对99Tcm标记EGFR mRNA反义PNA体外靶细胞摄取、荷瘤裸鼠体内生物学分布及特异性显像的影响。探索促进99Tcm标记EGFR mRNA反义肽核酸分子探针进入靶细胞的方法,进一步提高该核素分子探针肿瘤基因显像的效果。  方法:以EGFR mRNA(genbank序列号:NM_201283.1)的第503-519碱基序列(17bp)为靶序列,设计反义PNA5-AATGAGGACATAACCAG-3,于其5端连接由Gly-(D)-Ala-Gly-Gly4个氨基酸形成并且能与99Tcm进行强力螯合的类似N4结构的短肽,最后在PNA与该结构之间引入可以消除空间阻碍的隔离物γ-氨基丁酸(4-aminobutyric acid,Aba),完成反义PNA分子的合成。因PNA不带电荷,为了使反义PNA分子带负电荷以利于脂质体包裹,再合成与上述反义PNA3末端8个碱基互补的短寡核苷酸链,即5-CTGGTTAT-3结构。利用碱基互补配对原则将带有短肽螯合功能的EGFR mRNA反义PNA与部分互补寡核苷酸杂交,使反义PNA分子带负电荷后进行99Tcm标记,标记后以脂质体包裹反义探针。用反相高效液相色谱法(reverse-phase highperformance liquid chromatography, RP-HPLC)鉴定脂质体介导及非介导的99Tcm标记EGFR mRNA反义PNA(99Tcm-EGFR-PNA)的标记率。并将两者于37℃条件下分别在生理盐水及人新鲜血清中孵育1、2、4、6、12、24h,用RT-HPLC测定各自在不同介质及不同时间点的放射化学纯度,以检测其体外稳定性。并采用静置贴壁法培养人卵巢癌SKOV3细胞及人乳腺癌MDA-MB-435S细胞,收集对数生长期细胞,按每只裸鼠1×1011/L的浓度接种0.2ml到无特异病原体级裸鼠右前肢外侧皮下,当瘤体直径约1cm时,选取肿瘤形态规则、色泽红润、大小无明显差异的荷瘤裸鼠用于实验。用RP-HPLC测定EGFR高表达的SKOV3细胞荷瘤裸鼠注射脂质体介导及非介导分子探针后2-3h时的尿液中分子探针的放化纯,以监测分子探针体内稳定性。研究脂质体介导与非介导的分子探针在EGFR高表达的SKOV3细胞及EGFR低表达的MDA-MB-435S细胞的摄取以及滞留情况,以了解探针的药代动力学。取32只SKOV3细胞荷瘤裸鼠,利用随机数字表法分为2组,每组16只。各组分别注射脂质体介导及非介导99Tcm-EGFR-PNA。取16只MDA-MB-435S细胞荷瘤裸鼠,尾静脉注射脂质体介导99Tcm-EGFR-PNA。在各组内按随机数字表法分别于注药后1、2、4、6h各取4只动物模型,眼静脉取血后,颈椎脱臼处死,取各脏器分别测定其放射性计数并称重,测定3个标准源的放射性计数,计算每克组织中放射性计数与标准源(3个标准源均值)的比值即%ID/g以及肿瘤与肌肉组织的%ID/g比值(tumor to muscle,T/M)。比较各时间点脂质体介导对分子探针在动物模型体内分布的影响。取10只SKOV3细胞荷瘤裸鼠,利用随机数字表法分为2组,每组5只。各组分别注射脂质体介导及非介导的99Tcm-EGFR-PNA。取5只MDA-MB-435S细胞荷瘤裸鼠,尾静脉注射脂质体介导99Tcm-EGFR-PNA。均于注药后1、2、4、6、8、10h行静态显像,观察各组内随时间变化肿瘤部位放射性浓聚的变化,利用感兴趣区技术测定肿瘤部位放射性计数与对侧正常部位同等区域放射性计数的比值(target to nontarget ratio,T/NT),并比较3组间显像的差异。所有实验数据均采用SAS9.1统计学软件进行统计学分析,实验数据以均数±标准差表示,对数据进行两样本t检验(或t检验)或Wilcoxon秩和检验,以P<0.05为差异有统计学意义。  结果:经RP-HPLC法检测,脂质体介导及非介导的99Tcm-EGFR-PNA放射及紫外峰几乎均为单峰,放射峰保留时间分别为19min、12.5min,6h内标记率分别为(95.17±0.55)%(n=6)、(98.75±1.09)%(n=6),均较高,满足体内显像要求,无需进一步纯化。于37℃水浴条件下,在生理盐水及人新鲜血清中各孵育1、2、4、6、12和24 h,6h内分子探针放射化学纯度均在90%以上,且放射峰位置较稳定,未见漂移。RP-HPLC鉴定注射了脂质体介导或非介导分子探针的荷瘤裸鼠的尿液,其放射峰出现时间点均以标记物走样时的保留时间点为主,主峰前出现一小代谢物峰,但并非游离99TcmO4-。尿液中脂质体介导及非介导的分子探针的放化纯分别为89.3%和90.0%。  脂质体介导明显提高了EGFR高表达的SKOV3细胞对分子探针的摄取率(t=47.11-58.67,Z=2.80,均P<0.05),最高可达8.8倍。加入脂质体后细胞对反义探针的摄取高峰时间由不加脂质体时的6h延迟至12h。EGFR高表达的SKOV3细胞对脂质体介导99Tcm-EGFR-PNA的细胞摄取率明显高于MDA-MB-435S细胞对其摄取率(t=20.54-30.16,t=9.45,Z=2.80,均P<0.05)。脂质体介导后人卵巢癌SKOV3细胞对反义探针滞留率增加(t=7.25-11.55,Z=2.80,均P<0.05)。体内生物分布实验显示,在EGFR高表达SKOV3细胞荷瘤模型组,探针主要分布在肿瘤、肝脏、肾脏,肿瘤组织放射性计数明显高于瘤体对侧肌肉组织的放射性计数,并且随时间延长,逐渐增加。脂质体介导可以明显提高不同时刻T/M值(t=11.24,t=3.96-11.94,均P<0.05)。并且注射脂质体介导99Tcm-EGFR-PNA后SKOV3细胞荷瘤裸鼠各时间点的T/M值明显高于MDA-MB-435S细胞荷瘤裸鼠的T/M值(t=9.69,11.84,t=6.2,6.23,均P<0.05)。  体内显像实验显示,SKOV3细胞荷瘤裸鼠注射脂质体介导99Tcm-EGFR-PNA1h后肿瘤组织即有明显放射性核素浓聚,随时间延长浓聚程度增加,6h达摄取高峰,之后放射性核素浓聚程度轻度减低。SKOV3细胞荷瘤裸鼠非脂质体介导组,注药后1h肿瘤部位出现轻度摄取,6h达摄取高峰,之后放射性核素浓聚程度快速减低。并且脂质体介导可以明显增加各时间点T/NT值(t=3.96,t=12.65-14.69,Z=2.83-5.29,均P<0.05)。MDA-MB-435S细胞荷瘤裸鼠注射脂质体介导99Tcm-EGFR-PNA后,在显像时间内肿瘤部位无明显放射性核素浓聚。  结论:脂质体介导99Tcm-EGFR-PNA标记率高,体内外稳定性好,能够被EGFR高表达的细胞特异性摄取,可用于EGFR高表达肿瘤体内特异性显像。脂质体可以明显促进99Tcm-EGFR-PNA进入细胞,提高EGFR高表达肿瘤的显像效果,有助于肿瘤基因显像的诊断。
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