论文部分内容阅读
禽流感病毒(Avian Influenza virus,AIV)属于正黏病毒科,是一种有囊膜、基因组分节段的负链RNA病毒,可感染禽类、哺乳动物,甚至包括人类,严重威胁禽类与人类的健康。其基因组有8个片段,其中PA基因编码4种蛋白:PA、PA-N155、PA-N182和PA-X。PA-X蛋白是Jagger等人在2012年发现的,它是PA核糖体移码产生的+1阅读框编码的融合蛋白。PA-X蛋白作为新发现的由PA基因编码的病毒蛋白,被证明通过多种方式影响病毒的生命周期从而影响病毒的生物学特性和致病性。其作用主要包括1:调节流感病毒的毒力、聚合酶活性以及病毒诱导的细胞死亡和细胞因子免疫应答能力;2:具有核酸内切酶活性,可以广泛降解宿主的mRNA;3:发挥抑制宿主蛋白表达的功能(host-shutoff)。而且,在不同亚型以及不同宿主来源的流感病毒中,PA-X的以上功能存在差异。自2013以来,新型H7N9AIV感染人事件频频发生,给公共卫生安全带来了巨大的威胁。已有的研究表明,PA-X在不同亚型及其不同宿主之间发挥的作用不同。然而,其潜在的分子机制还不清楚。本研究首先基于大数据分析,探索各亚型之间PA-X基因多态性的差异,然后分别从多肽、蛋白、病毒水平进行PA-X基因多态性功能的研究。目前,国内外尚无PA-X蛋白对H7N9流感病毒致病性影响的相关研究。因此,后期蛋白水平和病毒水平的研究,我们将以H7N9流感病毒作为母本序列,以期通过体内外实验探索PA-X基因多态性对H7N9流感病毒生物学特性和致病性的影响,从而为解析不同亚型之间PA-X蛋白功能差异的分子机制奠定一定的基础。1.PA-X基因多态性分析及多肽水平研究PA-X基因多态性的功能我们从GISAID数据库分别下载H5N1、H5N6、H7N9、H9N2 PA-X基因的序列,按照禽源与哺乳源动物分类,一共下载了 589株禽源H5N1、75株人源H5N1、651株禽源H5N6、19株人源H5N6、917株禽源H9N2、9株人源H9N2、437株禽源H7N9、813株人源H7N9。通过生物学软件比对对PA-X序列进行分析,发现了一些规律性的位点突变。如在 37A、611、101D、193N、195R、199R、2281 这几个氨基酸位点,H7N9 与 H9N2PA-X序列突变率很高,而H5N1、H5N6 PA-X在这些位点突变率很低尤其是人源H5N1。在27D、58G、1291、208Q、213G、215P这6个氨基酸位点,H5N1的PA-X突变率很高,而H9N2、H7N9的PA-X的突变率很低。在20A、142K、251K这3个氨基酸位点,禽源H5N6突变率很高,而H5N1、H9N2、H7N9在这些点突变率很低。接下来,我们着重分析了从2013-2017年1359株H7N9病毒株分析序列,根据分析结果并结合已有关于PA-X功能区的文献,筛选出7条潜在功能的多肽,分别命名为pPA-X-1、pPA-X-2、pPA-X-3、pPA-X-4、pPA-X-5、pPA-X-6、pPA-X-7。并对合成的多肽进行了一系列功能研究。细胞死亡实验结果表明,多肽对细胞凋亡与坏死均无显著性影响。多肽抑制宿主蛋白表达实验结果证实pPA-X-1、pPA-X-4、pPA-X-7能显著抑制萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的表达,而pPA-X-5能显著抑制萤火虫荧光素酶的表达。多肽对小鼠致病性研究结果显示,与PBS对照组相比,所有多肽滴鼻组的小鼠都表现出了不同程度的体重下降,其中pPA-X-5与母本多肽pPA-X-3相比,在第1天显著抑制了小鼠体重的上升(p<0.05)。2.蛋白水平研究PA-X基因多态性的功能为了验证多肽水平的结果,我们以 1 株 H7N9 亚型 AIV A/Chicken/Guangdong/GD15/2016(简称 GD15 株)为研究对象,构建了表达 H7N9 GD15 株PA-X基因的真核表达载体(pCAGGS-GD15-PA-X-Flag)。依据多肽位点的差异,对pCAGGS-GD15-PA-X-Flag进行相应氨基酸位点的突变,并将重组表达质粒分别命名为:pCAGGS-PAX-2、pCAGGS-PAX-4、pCAGGS-PAX-5、pCAGGS-PAX-6、pCAGGS-PAX-7。从各重组PA-X质粒抑制GFP荧光的结果来看,所有表达的PA-X蛋白都显著地抑制了 GFP的表达(其中pCAGGS-PAX-6、pCAGGS-PAX-7表达质粒由于构建的过程中遇到问题,目前相关实验正在开展)。其中,各PA-X蛋白抑制GFP表达的能力由强到弱依次为:pCAGGS-PAX-2>pCAGGS-PAX-4>pCAGGS-PAX>pCAGGS-PAX-5;而从各重组质粒抑制海肾荧光素酶的表达能力来看,各重组PA-X蛋白都显著地抑制了海肾荧光素酶的表达,然而各个组抑制能力存在差异,其抑制海肾荧光素酶报告基因的能力由高到低依次为:pCAGGS-PAX-2>pCAGGS-PAX-4>pCAGGS-PAX>pCAGGS-PAX-5,与抑制 GFP 水平结果一致。因此,综合多肽水平和蛋白水平的结果,发现pCAGGS-PAX-4所处的功能区显著影响PA-X基因抑制宿主蛋白表达的效果,且是新发现的PA-X host-shutoff功能区。3.病毒水平研究PA-X基因多态性的功能为了进一步验证蛋白水平的结果,我们将蛋白水平对应的PA-X点突变回归到病毒水平,从而验证PA-X基因多态性对病毒生物学特性和致病性的影响。对应修饰位点的不同,将拯救的病毒分别命名为:GD15-PA、GD15-PA-2、GD15-PA-4、GD15-PA-5、GD15-PA-6、GD15-PA-7。对拯救的6株重组病毒进行初步的生物学特性研究,发现与母本病毒GD15-PA相比,GD15-PA-4、GD15-PA-5、GD15-PA-7 在 MDCK 上的 TCID50 显著高于母本病毒;小鼠致病性实验结果表明,与母本病毒相比,GD15-PA-4和GD15-PA-5对小鼠的致病性显著增高,表现为母本病毒的MLD50>6.5 lgEID50,而GD15-PA-4与GD15-PA-5的MLD50都为5.51gEID50;重组病毒在MDCK的复制曲线和在小鼠各组织脏器的复制结果表明,GD15-PA-4与GD15-PA-5的复制能力显著高于母本病毒GD15-PA;此外,聚合酶活性结果也表明,GD15-PA-4与GD15-PA-5的聚合酶活性要显著高于母本病毒;最后,小鼠肺组织细胞因子测定实验结果也表明,GD15-PA-4与GD15-PA-5诱导的细胞因子水平较母本病毒高。综上,我们认为以上结果共同解释了 GD15-PA-4与GD15-PA-5感染小鼠的肺脏损伤比母本病毒更为严重的原因。总的来说,本研究首先基于大数据分析,筛选出了潜在的PA-X蛋白功能区;然后分别从多肽水平、蛋白水平、病毒水平验证了这些潜在的PA-X蛋白功能区对PA-X蛋白功能的影响;最终发现了影响PA-X蛋白host-shutoff功能的新功能区与关键氨基酸位点,并探索了这些功能区对H7N9流感病毒生物学特性和致病性的影响。本研究为揭示不同亚型流感病毒PA-X蛋白功能的差异性以及PA-X蛋白调控各亚型流感病毒致病性差异的分子机制奠定了基础。后续实验我们正在将筛选到的功能区在不同亚型的流感病毒中进行验证,以期最终确定PA-X在不同亚型及不同宿主之间发挥的作用存在差异性的潜在分子机制。