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第一部分降钙素对DH豚鼠自发性腰椎间盘退变的作用目的:通过分析不同月龄Dunkin Hartley(DH)豚鼠腰椎间盘的组织学变化,探讨其是否存在增龄性自发退变;给予一定剂量降钙素(calcitonin,CT)干预,观察降钙素对该模型自发性腰椎间盘退变的防治效果。方法:1 42只雌性3月龄DH豚鼠随机分为2大组,对照组24只给予生理盐水干预,并分别于实施干预前(3月龄)、干预3个月(6月龄)、6个月龄(9月龄)和9个月(12月龄)后处死,实验组给予降钙素干预(8μg/kg/day,密盖息,诺华制药),分别干预3个月、6个月和9个月后处死,两组每个时间点均处死6只动物。2取L4-L6腰椎及椎间盘进行脱钙及常规石蜡包埋,制备4-μm切片并行VG染色,观察椎间盘的病理学改变并根据组织学评分系统对腰椎间盘的退变(lumbar vertebral degeneration,LVD)程度进行评分;测量L5-6椎间盘高度,测量左、中、右三个高度,取平均值,并与L6椎体高度作比;测量骨性终板多孔率以及骨性终板与软骨终板的比例。结果:1各组DH豚鼠体重变化:随着月龄的增高,豚鼠体重逐渐升高,与前一时间点结果比较,差异具有统计学意义(P<0.05);2椎间盘VG染色形态学观察发现:对照组3月龄组和6月龄组动物的腰椎间盘组织学无退变表现,9月龄组动物腰髓核较6月龄变窄,部分标本尾侧髓核与纤维环界限不清,中层部分失染,细胞数量减少,簇集现象较重;12月龄组椎间盘变形明显,髓核细胞丢失,粘液变性,纤维环完整性差,终板软骨及生长板软骨与软骨下骨界限模糊不清,软骨细胞变形坏死,且排列紊乱,深层有增殖细胞团生成。9月龄CT给药组与对照组相比纤维环仍致密及髓核相对饱满,终板软骨及生长板软骨显著骨化。同月龄CT干预组动物椎间盘更宽,髓核细胞更多,髓核与纤维环边界也更清晰;3椎间盘组织学评分显示:对照组随着DH豚鼠月龄增高,评分也不断升高,3、6月龄组间无明显差异,其余各组之间评分统计均有显著差异,具有统计学意义(P<0.05)。12月龄CT给药组评分显著低于对照组(P<0.05);4椎间盘高度:该模型椎间盘高度由3月到6月呈现增高趋势,9月龄时开始下降,12月龄较9月龄显著降低(P<0.05),12月龄CT治疗组椎间盘高度显著高于12月龄对照组。椎间盘高度与椎体高度的比值,9月龄对照组较6月龄对照组显著降低(P<0.05),12月龄CT治疗组椎间盘高度与椎体高度的比值显著高于12月龄对照组(P<0.05);5骨性终板面积比:9月龄和12月龄对照组骨性终板面积占总终板面积比显著高于3月龄和6月龄,12月龄CT治疗组该比值显著低于12月龄对照组(P<0.05)。第二部分降钙素对DH豚鼠腰椎间盘二型胶原、糖胺聚糖以及基质金属蛋白酶-1表达的影响目的:通过分析不同月龄DH豚鼠腰椎间盘的组织中二型胶原、蛋白聚糖以及基质金属蛋白酶-1的表达及降钙素对其表达的影响,探讨该模型基质代谢的增龄性变化及降钙素的作用。方法:1 42只雌性3月龄DH豚鼠随机分为2大组,对照组24只给予生理盐水干预,并分别于实施干预前(3月龄)、干预3个月(6月龄)、6个月龄(9月龄)和9个月(12月龄)后处死,实验组给予降钙素干预(8μg/kg/day,密盖息,诺华制药),分别干预3个月、6个月和9个月后处死,两组每个时间点均处死6只动物。2取L4-L5腰椎及椎间盘进行脱钙及常规石蜡包埋,制备4μm切片,采用免疫组化方法检测各组L4-5椎间盘髓核和纤维环中二型胶原、糖胺聚糖以及金属基质蛋白酶-1表达情况,应用Image pro-Plus 6.0软件对免疫组化阳性蛋白表达情况进行积分光密度(integrated optical density,IOD)计算,定量分析各组L4-5椎间盘中阳性细胞表达差异。结果:1免疫组织化学染色结果示二型胶原、糖胺聚糖以及基质金属蛋白酶-1在椎间盘和髓核均有阳性表达,着色浅黄或棕黄色不等,具体表达情况如下:二型胶原在髓核中表达情况:免疫组化染色及IOD分析结果示3月龄至9月龄动物二型胶原在髓核中的表达逐渐升高,12月龄动物二型胶原的表达下降,显著低于9月龄(P<0.05)。12月龄降钙素干预组二型胶原在髓核中的表达水平显著高于对照组(P<0.05);2二型胶原在纤维环中表达情况:免疫组化染色及IOD分析结果示二型胶原在纤维环中的表达高峰在6月龄,随后表达水平开始下降(P<0.05)。12月龄降钙素干预组二型胶原在髓核中的表达水平显著高于对照组(P<0.05);3糖胺聚糖在髓核中表达情况:免疫组化染色及IOD分析结果示3月龄至9月龄动物糖胺聚糖在髓核中的表达逐渐升高,12月龄动物糖胺聚糖的表达下降,显著低于9月龄(P<0.05)。12月龄降钙素干预组糖胺聚糖在髓核中的表达水平显著高于对照组(P<0.05);4糖胺聚糖在纤维环中表达情况:免疫组化染色及IOD分析结果示3月龄至9月龄动物糖胺聚糖在纤维环中的表达逐渐升高并达到高峰,12月龄动物糖胺聚糖的表达下降,显著低于9月龄(P<0.05)。12月龄降钙素干预组糖胺聚糖在髓核中的表达水平显著高于对照组(P<0.05);5基质金属蛋白酶-1在髓核中表达情况:免疫组化染色及IOD分析结果示3月龄至9月龄动物糖胺聚糖在髓核中的表达逐渐升高,12月龄动物糖胺聚糖的表达下降,显著低于9月龄(P<0.05)。9月龄降钙素干预组糖胺聚糖在髓核中的表达水平显著高于对照组(P<0.05);6基质金属蛋白酶-1在纤维环中表达情况:免疫组化染色及IOD分析结果示3月龄至9月龄动物糖胺聚糖在髓核中的表达逐渐升高,12月龄动物糖胺聚糖的表达下降,显著低于9月龄(P<0.05)。6、9和12月龄降钙素干预组糖胺聚糖在髓核中的表达水平均显著低于对照组(P<0.05)。第三部分降钙素对DH豚鼠椎体骨密度、微观结构和生物力学性能的影响目的:通过分析不同月龄DH豚鼠椎体骨密度、微观结构和生物力学性能,探讨该模型上述指标的增龄性变化及降钙素的干预效果。方法:1 42只雌性3月龄DH豚鼠随机分为2大组,对照组24只给予生理盐水干预,并分别于实施干预前(3月龄)、干预3个月(6月龄)、6个月龄(9月龄)和9个月(12月龄)后处死,实验组给予降钙素干预(8μg/kg/day,密盖息,诺华制药),分别干预3个月、6个月和9个月后处死,两组每个时间点均处死6只动物,留取所有椎体,检测以下指标:1骨密度检测:取L3-L5椎体,去除附着软组织,双能X线骨密度仪分别测量豚鼠L3-L5椎体的骨密度。2 Micro-CT分析:取L6椎体行Micro-CT检测,分析该节段松质骨骨量和微观结构。感兴趣区为距离两侧生长版1mm以内,直径1.5mm的圆柱体,计算椎体骨小梁结构数据:相对体积(bone volume/trabecular volume,BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)、骨小梁分离度(trabecular separation,Tb.Sp)、结构模型指数(structure model index,SMI),定量分析椎体骨结构参数。3生物力学分析:取L2椎体去除附着肌肉及软组织,打磨成上下面平行,约5mm高标本进行椎体生物力学测定,以0.5 mm/min速度进行压缩试验,计算椎体极限负荷(maximum load),屈服应力(yield stress),极限应力(maximum stress)及弹性模量(elastic modulus)用以评价大鼠腰椎椎体骨组织特性。结果:1腰椎3-5椎体及其间盘的骨密度检测结果:对照组与3月龄比较,6、9和12月龄BMD显著升高,差异有统计学意义(P<0.05),12月给药组较相同月龄对照组BMD升高明显,差异具有统计学意义(P<0.05)。2 Micro-CT检测结果:12月龄DH豚鼠BV/TV值显著低于其余月龄组,Tb.Sp和SMI显著高于其余月龄组(P<0.05),12月龄给药组BV/TV显著高于同月龄对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。3椎体生物力学分析结果:随着月龄的增高,对照组最大载荷(maximum load)、最大应力(maximum stress)、屈服强度(yield stress)、弹性模量值升高,与3月龄比较,6、9、12月龄组上述指标显著升高,差异有统计学意义(P<0.05),6、9、12月龄组之间两两比较,差异无统计学意义(P>0.05)。各月龄给药组最大载荷(maximum load)、最大应力(maximum stress)、屈服强度(yield stress)值均显著高于同月龄对照组,6月龄给药组弹性模量显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1雌性DH豚鼠的IVD存在退变性改变,其病变程度随动物月龄增长呈现逐渐加重趋势。因此,DH豚鼠是一种可靠的原发性IDD动物模型,其在一定程度上反映了人类IDD的发生发展过程,可在此模型基础上进一步探讨IDD发生的机制及其相关危险因素。2与9月龄动物相比,12月龄DH豚鼠椎间盘组织中二型胶原、糖胺聚糖的含量显著下降,基质金属蛋白酶-1的表达水平显著升高,而降钙素干预可显著抑制上述改变,提示降钙素对该模型椎间盘退变的抑制作用可能与此有关。3给予CT干预能改善椎体松质骨微观结构,维持其生物力学性能从而改善椎间盘生物学环境,发挥防治椎间盘退变的作用。