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该文利用细胞双杂交技术,对Restin在细胞周期中可能的作用的转录因子进行了筛选:一、首先从Gene Bank中筛选了31个与细胞周期密切相关的转录因子,设计了特异性引物.从胎儿组织和刺激后的淋巴细胞中克隆了这些转录因子并构建于细胞双杂交系统的pACT质粒中.这些转录因子与细胞的增殖、分化、应激、调亡相关,它们可以独立或经修饰或和配体分子相互作用而参与细胞周期的调控.最后我们得到6个编码氨基酸正确的转录因子:ATF3、ATF4、E2F6、C-JUN、C-FOS、p53.二、完整的诱饵蛋白Restin基因克隆在细胞双杂交系统的pBIND质粒中.首先对构建的转录因子(pACT-TFs)质粒和诱饵(pBIND-restin)质粒进行检测有无自激活现象,通过与双杂交阳性对照相比较,证明所构建的质粒转染后没有出现自激活现象,可以进行双杂交筛选;随后将pBIND-restin和六种pACT-TFs3进行双杂交,结果发现ATF3与Restin表现出强烈的相互作用,其余五个转录因子不与Restin发生相互作用.三、为了进一步验ATF3与Restin的相互作用,对ATF3进行截断并构建了一系列ATF3的截短片段的双杂交质粒(仍然构建于pACT载体中),再次运用细胞双杂交进行相互作用的探索.所构建的质粒为:pACT-ATF3-AD(转录激活结构域)、pACT-ATF3-BD(DNA结合结构域)、pACT-△ ATF3(含全部转录激活结构域和部分DNA结合结构域N端)、pACT-ATF3-△ BD(含有不完整的DNA结合结构域C端).构建的截断片段与Restin和萤火虫荧光酶报告基因共转染COS-7细胞24小时后检测荧光酶活性,结果发现Restin与ATF3的确存在相互作用,并作用于ATF3的DNA结合结构域,不完整的DNA结合结构域降低了Restin与ATF3相互作用能力,进一步证实了Restin与ATF3相互作用.ATF3是在组织或细胞生理压力性诱导应激反应中最早表达的转录因子.一方面,ATF3可以诱导细胞从静止期进入细胞周期;另一方面它阻止毒性物质诱导的细胞凋亡.激活的ATF3可以通过JNK/SAPK信号传递途径抑制细胞内部分基因的转录和细胞的增殖.因此我们推测Restin对细胞增殖的抑制作用可能与ATF3活性的抑制有关.我们正在构建ATF3的报告系统,来研究ATF3与Restin相互作用的效应.