论文部分内容阅读
第一部分益气化湿通络方对5/6肾切除大鼠一般状况、肾功能及肾组织形态学的影响目的:观察益气化湿通络方对5/6肾切除大鼠一般情况、肾功能及肾脏病理形态的改善作用,为进一步探讨此方可能的作用机制提供可靠的实验依据。方法:采用Platt法建立5/6肾切除慢性肾功能衰竭大鼠模型。造模成功后,将32只雄性SD成年大鼠,随机分成为:模型组(Model)、益气化湿通络方组(Yiqi Huashi Tongluo Formula,YHT)、贝那普利组(Benazepril Hydrochloride,BH)、假手术组(Sham),每组8只。每日灌胃治疗1次(YHT组,免煎中药颗粒水溶液0.276g/100g/d;BH组,盐酸贝那普利片剂水溶液0.09mg/100g/d灌胃;Sham及Model组,1ml/100g/d去离子水灌胃),连续治疗12周。收集SD大鼠12周末的24小时尿液,用于24小时尿蛋白定量检测。行SD大鼠腹主动脉取血,分离出血清,用于检测血肌酐(serum creatinine,Scr)、血尿素氮(urea nitrogen,BUN)含量;摘取左肾,用滤纸吸干水分后称重,分成两部分保存,一部分保存于-80℃冰箱中,一部分保存于4%多聚甲醛中固定,留待检测。将4%多聚甲醛固定的肾组织行病理切片,用HE、Masson、碘酸雪夫氏反应染色(Periodic Acid-Schiff stain,PAS)、天狼星红染色(Picrosirius red staining),观察残存肾组织病理形态学改变情况。以上数据应用均数±标准差((?)±s)示,各组用单因素方差(one-way ANOVA)分析的均值以Newman-Keuls检验法作两两比较。结果:1、大鼠一般状况:Sham组大鼠摄食饮水、大小便均正常,毛发光亮,耳廓红润,尾部红润,活动反应均正常。Model组、YHT组和BH组大鼠进食均有不同程度减少,饮水增多,尿量逐渐增多,脱毛少光泽,耳廓发白、尾部发白湿冷,精神萎靡不振,活动量减少,其中Model组大鼠改变最明显,治疗组均较Model组有所改善。体重记录显示Model组大鼠体重低于Sham组的大鼠体重,YHT或BH干预后体重有升高(P<0.01),YHT组和BH组差异无统计学意义(P>0.05)。2、大鼠存活率:清洁级健康雄性SD大鼠50只,随机分为组:sham组10只,造模组40只。Sham组10只大鼠进行剥离两侧肾包膜操作,不切除肾脏,试验期间死亡2只。其余采用5/6肾切除术造模,试验期间Model组死亡7只,YHT组死亡4只,BH组死亡4只,本实验模型存活率约60%。3、左残存肾重量:与Sham组相比,Model组大鼠残肾重量明显降低。与Model组相比,YHT组和BH组残肾重量增加(P<0.01)。YHT组和BH组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。4、大鼠24小时尿蛋白定量:与Sham组相比,Model组大鼠24h尿蛋白排出量明显增多。与Model组相比,YHT组和BH组24小时尿蛋白排出量减少(P<0.01)。YHT组和BH组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。5、大鼠BUN、SCr水平:与Sham组相比,Model组大鼠BUN、SCr明显升高。与Model组相比,YHT组或BH组大鼠的BUN、SCr水平明显降低(P<0.01),YHT组与BH组比较,结果未表现出显著差异(P>0.05)。6、大鼠残存肾脏组织病理学6.1残存肾大体形态变化Sham组,组织呈红褐色,表面光滑湿润,被膜易剥离,切面皮质髓质界限清楚。Model组左残存肾组织呈灰褐色,体积小、重量轻,质地硬脆,表面呈均匀弥漫细颗粒,被膜不易剥离,切面皮质变薄。YHT组和BH组左侧残存肾组织体积增大、重量增加,质地较软,表面少量细颗粒状,被膜不易剥离,切面皮质较厚。6.2残存肾组织光镜下形态变化HE、Masson、PAS、天狼星红染色后显示:Sham组大鼠的肾小球结构清晰,未见充血、萎缩、肾小管上皮细胞排列整齐,基底膜完整,间质中未见明显炎症细胞浸润。Model组大鼠的肾小球硬化,玻璃样变,肾小球萎缩,毛细血管袢塌陷,肾小管上皮细胞变性、坏死,脱落,小管萎缩、消失,肾小管出现扩张,肾间质基质明显增多、大量淋巴细胞为主炎细胞浸润,泡沫细胞出现。YHT组和BH组肾小球硬化、肾小管萎缩及间质纤维化程度均有不同程度减轻。小结:1、本研究采用5/6肾切除术成功复制了SD大鼠慢性肾功能衰竭的病理模型,为研究治疗慢性肾功能衰竭CRF及肾脏纤维化提供了典型稳定可靠的实验基础;2、益气化湿通络方能有效改善CRF大鼠的一般状况、肾功能及肾脏纤维化的程度,其疗效与盐酸贝那普利相当;3、益气化湿通络方是在中医理论指导下,根据CRF临床病因病机特点,结合“三焦分而治之”法则创立的且长期应用于临床的有效自拟方,本研究为其临床应用提供了有力的实验数据。第二部分益气化湿通络方对5/6肾切除大鼠肾脏纤维化相关蛋白的影响目的:探讨益气化湿通络方通过调节5/6肾切除大鼠肾纤维化相关蛋白的表达以阻抑肾脏纤维化的机制。方法:造模、分组与用药同第一部分,用Western blot技术检测大鼠肾组织转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(CollagenⅢ)的蛋白表达情况;免疫组化法观察FN、CollagenⅢ蛋白在残存肾组织的表达情况;荧光染色观察TGF-β1在残存肾组织中的表达情况;实时荧光定量PCR检测FN m RNA表达水平。结果:1、益气化湿通络方对肾组织中TGF-β1蛋白表达的影响1.1.Westernblot技术检测大鼠肾组织TGF-β1蛋白表达情况,与Sham组相比,Model组大鼠肾组织TGF-β1蛋白表达水平明显增高(P<0.01);与Model组比较,各治疗组TGF-β1表达水平均明显降低(P<0.01)。YHT组和BH组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。1.2.荧光染色观察TGF-β1在肾组织表达情况,标记TGF-β1蛋白染色为绿色荧光,DAPI染色细胞核为蓝色荧光。TGF-β1免疫荧光结果显示,Sham组几乎没有绿色荧光表达;Model组绿色荧光强度高,提示Model组中TGF-β1蛋白高表达;YHT或BH干预后绿色荧光强度较Model组降低。2、益气化湿通络方对肾脏组织中FN、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白的影响2.1.Westernblot技术检测大鼠肾组织FN、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表达情况。与Sham组相比,Model组大鼠肾组织FN、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表达水平明显增高(P<0.01);与Model组比较,各治疗组FN、CollagenⅠ、CollagenⅢ表达水平均明显降低(P<0.01)。YHT组和BH组差异比较,无统计学意义(P>0.05)。2.2.免疫组化法观察FN、CollagenⅢ蛋白表达情况。与Sham组比较,Model组大鼠肾组织FN、CollagenⅢ蛋白呈棕黄色小颗粒状,主要在肾小球中呈现阳性反应,各蛋白表达量明显增高(P<0.01);与Model组比较,各治疗组FN、CollagenⅢ蛋白表达量均明显降低(P<0.01)。YHT组和BH组差异无统计学意义(P>0.05)。2.3.qPCR(quantitative real-time PCR,实时荧光定量PCR)法检测FN m RNA在各组大鼠肾组织中的表达。与sham组相比,Model组大鼠肾组织中FN m RNA表达量增高(P<0.01);与Model组比较,各治疗组FN m RNA表达量降低(P<0.01)。比较YHT组和BH组差异无统计学意义(P>0.05)。小结:益气化湿通络方可能是通过调节TGF-β1及其介导的促肾脏纤维化蛋白FN、CollagenⅠ、CollagenⅢ的表达,起到阻抑肾脏纤维化的作用。本研究为益气化湿通络方治疗CRF及肾脏纤维化提供了分子生物学依据。第三部分益气化湿通络方对5/6肾切除大鼠肾组织Nrf2-keap1信号通路的影响目的:探讨Nrf2-keap1信号通路在益气化湿通络方阻抑5/6肾切除大鼠肾纤维化中的作用,并进一步探讨益气化湿通络方治疗作用的可能机制,为临床应用提供试验依据。方法:造模、分组与用药同第一部分,12周末剖杀大鼠检测肾组织匀浆超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)的活性和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量;ELISA法检测肾组织中炎性因子白介素6(Interleukin-6,IL-6),白介素1(Interleukin-1,IL-1)白介素10(Interleukin-10,IL-10)和肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)的表达情况;Western blot技术检测肾组织中氧化应激相关因子,核因子NF-E2相关因子(Nuclear factor-erythroid 2-related factor2,Nrf2)、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1)、NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4,Nox4)、血红素氧合酶1(Heme Oxygenase-1,HO-1)、活化核因子-kappa B(Nuclear factor kappa b,NF-κB)、细胞间黏附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的表达;免疫组化法观察NF-κB、ICAM-1、Nox4蛋白表达情况;荧光染色观察Nrf2和TNF-α在肾组织细胞核内的表达情况;实时荧光定量PCR检测Nrf2 m RNA表达水平。结果:1、益气化湿通络方对肾脏组织SOD活性和MDA含量的影响与Sham组相比,Model大鼠肾组织中SOD活性降低和MDA含量升高,与Model组相比,YHT组和BH组大鼠的肾脏组织SOD活性增加和MDA含量下降(P<0.01)。YHT组和BH组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。2、益气化湿通络方对肾脏组织中炎症相关因子IL-6,IL-1,IL-10和TNF-α、NF-κB、ICAM-1的影响2.1.ELISA法检测各组大鼠肾组织IL-6,IL-1,IL-10和TNF-α蛋白表达情况。与Sham组相比,Model组大鼠肾组织IL-6,IL-1和TNF-α蛋白表达水平明显增高,IL-10蛋白表达水平明显降低(P<0.01);与Model组比较,各治疗组IL-6,IL-1和TNF-α蛋白表达水平均明显降低(P<0.01),IL-10蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。YHT组和BH组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。2.2.Westernblot技术检测大鼠肾组织NF-κB、ICAM-1的蛋白表达情况。与Sham组相比,Model组大鼠肾组织NF-κB和ICAM-1蛋白表达水平明显增高(P<0.01);与Model组比较,YHT或BH干预治疗后NF-κB和ICAM-1蛋白表达水平均明显降低(P<0.01)。YHT组和BH组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。2.3.免疫组化法观察NF-κB、ICAM-1蛋白表达情况。与Sham组比较,Model组大鼠肾组织NF-κB、ICAM-1蛋白呈棕黄色小颗粒状,主要在肾小球中呈现阳性反应。蛋白表达量明显增高(P<0.01);Model与组比较,各治疗组NF-κB、ICAM-1蛋白表达量均明显降低(P<0.01)。YHT组和BH组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。2.4.荧光染色观察核NF-κB在细胞核内的表达情况,红色荧光标记NF-κB蛋白,DAPI染色细胞核为蓝色荧光。结果显示:NF-κB蛋白Sham组几乎没有红色荧光表达;Model组红色荧光强度高,NF-κB蛋白高表达;YHT或BH干预后细胞核中红色荧光强度较Model组降低。3、益气化湿通络方对肾脏组织中氧化应激相关因子Nrf2、Keap1、Nox4、HO-1的影响3.1.Westernblot技术检测大鼠肾组织Nrf2、Keap1、Nox4、HO-1的蛋白表达情况。与Sham组相比,Model组大鼠肾组织Keap1、Nox4蛋白表达水平明显增高,Nrf2、HO-1蛋白表达水平明显降低(P<0.01);与Model组比较,YHT或BH干预治疗后Keap1、Nox4蛋白表达水平均明显降低(P<0.01),Nrf2、HO-1蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。YHT组和BH组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3.2.免疫组化法观察Nox4蛋白表达情况。与Sham组比较,Model组大鼠肾组织Nox4蛋白呈棕黄色小颗粒状,主要在肾小球中呈现阳性反应。蛋白表达量明显增高(P<0.01);与Model组比较,各治疗组Nox4蛋白表达量均明显降低(P<0.01)。YHT组和BH组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3.3.荧光染色观察核Nrf2在细胞核内的表达情况,标记Nrf2蛋白为红色荧光,DAPI染色细胞核为蓝色荧光。结果显示:与Sham组相比较,Model组肾组织细胞核内Nrf2蛋白的表达明显减少,YHT组或BH组较Model组Nrf2的表达增多明显。3.4.qPCR法检测Nrf2 m RNA在各组大鼠肾组织中的表达情况。与Sham组相比,Model组大鼠肾组织中Nrf2 m RNA表达量减少(P<0.01);与Model组比较,各治疗组Nrf2 m RNA表达量增加(P<0.01)。YHT组和BH组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。小结:1、5/6肾切除大鼠肾组织SOD活性显著降低,MDA含量显著增加,IL-1、IL-6等炎性介质的表达明显升高,IL-10抗炎因子表达减少,此模型存在抗氧化能力减低和氧化应激增强、抗炎能力减低和炎症损伤加重;2、5/6肾切除大鼠肾组织中Nrf2/Keap1信号通路可影响氧化应激和炎症相关蛋白Nox4、HO-1、IL-6、IL-1、IL-10、NF-κB、TNF-α、ICAM-1的表达。YHT干预调节Nrf2/Keap1信号通路,影响了上述蛋白表达,纠正了5/6肾切除大鼠肾组织炎症信号与抗氧化反应的失衡,明显提高5/6肾切除大鼠抗氧化能力,抑制其氧化应激,减轻其炎症反应,这可能就是YHT治疗CRF,阻抑肾纤维化的机制之一。结论:1、本研究采用5/6肾切除术成功制造了SD大鼠慢性肾功能衰竭的病理损伤,为研究治疗慢性肾功能衰竭及肾脏纤维化提供了典型稳定可靠的动物模型;2、益气化湿通络方能有效改善慢性肾功能衰竭大鼠的一般状况、肾功能及肾脏纤维化进程,其疗效与盐酸贝那普利相当;3、益气化湿通络方是在中医理论指导下,根据CRF临床病因病机特点,结合“三焦分而治之”法则创立的且长期应用于临床的有效自拟方,本研究为其临床应用提供了有力的实验数据;4、益气化湿通络方通过影响TGF-β1及其介导的促肾脏纤维化进展的相关蛋白的表达,阻抑肾脏纤维化;5、益气化湿通络方通过影响Nrf2-Keap1信号通路调节了炎症信号与抗氧化反应的失衡,影响促纤维化蛋白表达,从而实现治疗CRF及阻抑肾纤维化,此可能为YHT的作用机制之一,因此Nrf2-Keap1信号通路可作为阻抑肾脏纤维化治疗的新靶点。