论文部分内容阅读
前言腱-骨界面愈合一直是临床面临的棘手问题。腱-骨愈合问题存在于全身所有腱-骨连接部,其中,肩袖止点、跟腱止点等部位尤为明显。肩袖损伤重建后2年内11%-94%的患者影像学上观察到修复失败;这些都对社会和家庭造成巨大的负担,腱止点的修复与重建相关研究是国家在人口与健康领域的重大需求。不同界面的处理方式影响腱-骨界面愈合的质量。传统观点认为,肌腱止点修复前必须对腱-骨界面进行彻底清创让其新鲜化,腱-骨界面新鲜化处理包括去皮质和保留皮质两种主要形式。然而,不同界面处理对腱-骨愈合影响有待进一步探讨,相关机制尚不清楚。影响腱-骨愈合的因素主要有:止点修复前的界面处理、修复方式、促进腱-骨愈合的组织工程手段(如:生长因子、基因治疗、骨膜封闭肌腱、成骨诱导材料、细胞治疗、生物可降解支架和仿生补片等)以及个体的性别、年龄、术后康复策略等,这些因素使得愈合的腱-骨界面无论在功能上和生物学上与生理性腱-骨界面均有较大差别。前期研究发现,腱糖蛋白-C(Tenascin-C,TNC)与腱-骨愈合过程可能存在密切的联系,肌肉和肌腱损伤时有大量TNC表达,TNC可能是影响腱-骨愈合的关键因素之一。本课题拟通过制作跟腱止点急性损伤完全断裂后不同界面处理修复的大鼠模型,并对愈合腱-骨界面进行各种检测,寻找TNC与不同界面处理后腱-骨愈合的关系;采用不同比例肌腱干细胞(TSCs)、骨髓间充质干细胞(BMSCs)混合共培养的方式模拟这两种细胞在腱-骨愈合界面相遇的情况,并检测TNC对TSCs、BMSCs及不同比例混合共培养细胞增殖以及特定条件下与分化有关基因表达的影响。方法第一部分:制作大鼠急性跟腱止点断裂修复模型,采用保留原有止点纤维软骨层、去除原有止点纤维软骨层和骨隧道的界面处理方式进行修复跟腱;通过最大破坏负荷和刚度这两个生物力学测试指标,检测腱-骨愈合质量和强度;采用microCT扫描测定BMD、BV/TV这两个指标观察腱-骨界面骨结构动态变化情况;对腱-骨界面组织进行HE、Masson、番红O染色,观察界面组织形态,了解腱-骨界面愈合情况。第二部分:采用免疫组化方法对不同界面处理方式手术修复的腱-骨愈合界面及跟腱近端腱-肌连接处骨钙素、SOX-9和TNC不同时间点的表达进行检测,通过Image-Pro Plus软件将图像(200×)转化为灰度图提取数据后计算出平均光密度值,从而对这三种蛋白的表达进行半定量分析。采用不同比例TSCs、BMSCs混合共培养的方式模拟这两种细胞在腱-骨愈合界面相遇的情况,检测不同剂量的TNC对TSCs、BMSCs及不同比例混合共培养细胞增殖的影响以及TNC对TSCs、BMSCs及等比例直接混合共培养细胞在固定的培养时间(3d),固定TNC剂量(1μg/ml)条件下成软骨(SOX-9)、成骨(RUNX2)、成肌腱(SCX)、成脂(PPARγ)基因标志物mRNA表达的影响。结果第一部分:1.通过对不同界面处理后愈合的大鼠跟腱-跟骨复合体的力学测试发现:术后4w(34.42±4.65 N vs 60.78±6.63N)和8w(41.21±3.38 N vs 60.05±5.25 N)保留原有止点纤维软骨组织修复愈合的大鼠跟腱-跟骨复合体的最大破坏负荷均较自身对照显著降低;术后8w各组刚度均较自身对照显著降低(分别为G1:33.96±5.59 N vs 58.59±6.54 N/mm;G2:25.96±2.80 N vs 50.20±8.29 N/mm;G3:32.73±5.20 N vs 59.12±10.17 N/mm)。而同一时间点各组手术组之间以及各组对照组之间对比没有显著统计学差异。2.术后4w和8w时,去除原有止点纤维软骨组织后手术修复的界面骨端的BMD(4w:0.378±0.041 g/cm~3 vs 0.808±0.014 g/cm~3;8w:0.349±0.009 g/cm~3 vs 0.795±0.030 g/cm~3)和BV/TV(4w:33.82±4.35%vs 76.24±1.77%;8w:37.33±5.80 vs 70.28±2.39%)均较自身对照组假手术组显著降低。3.保留原有止点纤维软骨组织手术修复界面中的软骨样细胞存在一个减少后重新出现的过程,表现为:纤维结构逐渐紊乱,原有止点处肥大软骨样细胞逐渐减少,至术后4w又开始出现至术后8w逐渐增多。去除原有止点纤维软骨层后修复愈合界面术后1w即开始出现巢团样软骨,至术后8w巢团样软骨样细胞团逐渐增多,软骨样细胞团之间可见Sharpey’s纤维,纤维排列较保留原有止点纤维软骨层的手术组更有序。去除原有止点纤维软骨层后修复止点的腱骨界面明显可见更多番红O染色的软骨细胞。第二部分:1.术后4w和8w时,两种界面处理方式修复大鼠跟腱止点的腱-骨界面骨端的骨钙素染色的平均光密度值均较对照组低(4w control vs G1 vs G2:0.0438±0.0062 vs0.0116±0.0009 vs 0.0067±0.0008;8w:0.0837±0.0244 vs 0.0269±0.0066 vs 0.0066±0.0005)。2.术后1w两种界面处理方式的手术修复组腱-骨界面处软骨样细胞SOX-9的平均光密度值显著升高,并且达到峰值(Control vs G1 vs G2:0.039±0.004 vs 0.068±0.006 vs 0.069±0.006),在随后的2w、4w、8w时间点则呈逐渐下降的趋势(2w:0.057±0.007 vs 0.045±0.002 vs 0.027±0.004;4w:0.021±0.002 vs 0.040±0.002 vs 0.023±0.003;8w:0.029±0.008 vs 0.024±0.006 vs 0.035±0.003)。3.不同界面处理后修复止点的大鼠跟腱近端腱-肌连接处TNC免疫组化染色在不同组别、不同时间点呈现不同的变化趋势:保留原有止点纤维软骨结构修复止点的大鼠表现为在术后4w达到峰值水平(0.119±0.001)随后降低;去除原有止点纤维软骨结构修复止点的大鼠表现为在术后2w达到峰值(0.082±0.003),且其峰值在三组中最低;对照组表现为在术后2w达到峰值(0.159±0.006),且在术后8w时与手术组有显著差异(Control vs G1 vs G2:0.013±0.001 vs 0.038±0.005 vs 0.040±0.006)。4.BMSCs的增殖速率显著低于TSCs。直接混合共培养细胞增殖速率在培养3d后增殖曲线与TSCs比较无显著差异。2d和3d时,1:1直接混合共培养细胞在无论加入何种剂量(1μg/ml、10μg/ml和100μg/ml)TNC其增殖均与未加入TNC有显著差异。5.在BMSCs-TSCs直接混合共培养系统中,RUNX2和SOX-9基因表达在TNC刺激下显著增加,且TNC能明显抑制TSCs SCX基因的表达。而在BMSCs-TSCs的间接共培养系统中,BMSCs和TSCs的各向分化的基因标志物表达在TNC刺激下没有显著的统计学差异。6.Y-27632,PQ 401和PD 98059能影响TNC促进1:1直接混合共培养细胞RUNX2和SOX-9基因表达和抑制TSCs SCX基因表达的效应。结论1.大鼠跟腱急性断裂后修复模型中采用去除原有止点纤维软骨层修复和骨隧道修复这两种界面处理方式的腱-骨愈合质量较保留原有跟腱止点原有纤维软骨组织界面处理方式的愈合质量更好。采用去除原有止点纤维软骨层界面处理方式会导致修复后早期重建止点骨端的骨量持续、显著的减少。去除原有止点纤维软骨层的界面处理方式具有更好的界面形态。2.大鼠跟腱急性断裂后手术修复前的不同界面处理方式造成了腱-骨界面骨钙素、SOX-9及跟腱近端腱-肌交界处TNC表达差异。这种差异可能与腱-骨界面的纤维软骨层形成有关。3.1:1直接混合共培养能改变BMSCs和TSCs对TNC刺激条件下的增殖。在培养3d,TNC剂量1μg/ml条件下:TNC能改变等比例直接混合共培养细胞的增殖,促进RUNX2和SOX-9基因表达。TNC能单独抑制TSCs细胞SCX基因表达。TNC改变等比例直接共培养细胞和TSCs分化基因标志物表达的效应与ROCK,IGF-1R和ERK相关的信号通路有关。