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目的建立新的小鼠骨癌痛模型,观察NMDA受体2B亚基(NR2B)在骨癌痛小鼠前脑扣带回和脊髓中的表达及分布情况；明确NR2B与癌痛产生之间的关系；探讨NR2B在小鼠骨癌痛中的作用机制。方法1.小鼠骨癌痛新模型的制备及评价：选用成年雄性C57BL／6小鼠30只,随机分为4组,模型组(15只)：接种Lewis肺癌细胞2×106个；热灭活组(5只)：接种相同数目加热灭活的Lewis肺癌细胞；PBS组(5只)：接种等容积的PBS液；正常对照组(5只)：不予任何处理。接种后7天始隔日观察小鼠自发痛行为及测定机械性触诱发痛。第7、15、23天,将小鼠麻醉后行双侧后肢X线摄片,评估肿瘤诱发的骨组织破坏程度。模型组小鼠每次摄片后任选5只取术侧后肢,各对照组小鼠最后一次摄片后取术侧后肢,分别作苏木素-伊红(HE)染色观察骨质破坏情况。2.NR2B在骨癌痛小鼠前扣带回和脊髓中的分布与表达：选用成年雄性C57BL/6小鼠81只,随机分为3组：癌痛组,假手术组和正常对照组。观察三组小鼠自发痛行为及测定机械性触诱发痛。分别于术后第6、10、14、18、22天各取3只,实时定量PCR检测前扣带回和脊髓NR2B mRNA的表达。依据PCR结果,每组分别于术后第14、18天各取3只,免疫组化检测前扣带回和脊髓NR2B的分布和表达；同时每组另各取3只,于术后第14、18天行Western Blot检测脊髓NR2B蛋白的表达。3.脊髓NR2B基因沉默对小鼠骨癌痛的影响：选用成年雄性C57BL／6小鼠72只,随机分为3组：癌痛组,干扰组和干扰对照组。观察各组小鼠自发痛行为及测定机械性触诱发痛。每组分别于接种后第13、14、15、16、18、22天各取3只,实时定量PCR检测脊髓NR2B mRNA的表达。依据PCR的结果,于接种后第14和18天每组各取3只,Western Blot检测脊髓NR2B蛋白的表达。4.MAPK信号通路介导的NR2B在小鼠骨癌痛中的作用机制：选用成年雄性C57BL／6小鼠48只,随机分为4组：正常组,癌痛组,干扰组和干扰对照组。观察各组小鼠自发痛行为及测定机械性触诱发痛。每组分别于接种后第14和18天各取3只,实时定量PCR检测脊髓NR2B、SP、c-fos和GFAP基因表达水平。选取接种后第14和18天的每组小鼠各3只,Western Blot检测脊髓NR2B、p-ERK、p-p38和GFAP蛋白表达水平。结果1.小鼠骨癌痛新模型的评价：模型组接种后第11天左右出现明显自发痛行为,表现为自发抬足时间延长；接种后第13天左右出现明显的触诱发痛,表现为50%缩足阈值明显下降,且持续整个观察期。接种后第23天放射学结果显示,术侧股骨下段骨髓腔消失,骨皮质中断、大块缺损。同时组织学可见肿瘤细胞充满骨髓腔,且穿破骨皮质向外生长,侵犯周围肌肉组织。行为学、放射学、组织学三方面证实建模成功。2.NR2B在骨癌痛小鼠的前扣带回和脊髓中的分布与表达：(1)前扣带回NR2B的实时荧光定量PCR结果显示：接种后第6天、10天,癌痛组NR2B的表达与假手术组比较无显著差异,而癌痛组和假手术组NR2B的表达比正常组明显增高；第14天、18天,癌痛组NR2B的表达明显增加,与假手术组和正常组比较,有显著差异(p<0.05),而假手术组与正常组比较,无显著差异(p>0.05)；第22天,癌痛组NR2B的表达下降,与假手术组和正常组比较无统计学意义。L4-6段脊髓NR2B的实时荧光定量PCR示：接种后第6天,癌痛组NR2B的表达与假手术组比较无显著差异,而癌痛组和假手术组NR2B的表达比正常组明显增高；第10、14、18、22天,癌痛组NR2B的表达明显增加,与假手术组和正常组比较,有显著差异(p<0.05)；而假手术组与正常组比较,无显著差异(p>0.05)。(2)L4-6段脊髓和前扣带回NR2B免疫组化测定结果：癌痛组NR2B主要分布在脊髓背角浅层、中央导水管、前角以及小鼠的前扣带回,脊髓各层NR2B表达量在中央导水管、背角浅层、前角依次增多。癌痛组于术后第14、18天,脊髓和手术对侧的前扣带回区NR2B阳性细胞光密度(OD)值与假手术组和正常组比较有统计学差异(P<0.05)；而假手术组与正常组比较,无显著差异(p>0.05)。(3)L4-6段脊髓NR2B表达的Western Blot检测结果：癌痛组于接种后第14天、18天,脊髓NR2B的表达明显增高,与假手术组和正常组比较,有显著差异(p<0.05)；而假手术组与正常组比较,无显著差异(p>0.05)。3.脊髓NR2B基因沉默对小鼠骨癌痛的影响：(1)实时定量PCR检测小鼠脊髓NR2B mRNA的表达：接种后第14天和第18天干扰组小鼠L4-6段脊髓的NR2B mRNA表达水平比癌痛组明显降低,其中第14天下调最明显,干扰组比癌痛组NR2B的表达下调了74%；而干扰对照组与癌痛组比较,无显著差异(p>0.05)。(2)Western Blot检测小鼠脊髓NR2B蛋白的表达：接种后第14和18天干扰组小鼠L4-6段脊髓的NR2B表达水平比癌痛组明显降低,其中第18天下调最明显,干扰组比癌痛组NR2B表达下调了67%；而干扰对照组与癌痛组比较,无显著差异(p>0.05)。(3)干扰组与其他两组相比,自发抬足时间明显缩短,触诱发痛阈值明显增加,有显著差异(p<0.05)。4.MAPK信号通路介导的NR2B在小鼠骨癌痛中的作用机制：(1)实时定量PCR检测各组小鼠L4-6段脊髓的NR2B、SP、c-fos和GFAP基因mRNA的表达：接种术后第14、18天癌痛组小鼠脊髓的NR2B、SP、c-fos和GFAP基因表达比正常组明显上调(p<0.05)；干扰组NR2B、SP、c-fos和GFAP基因表达比癌痛组显著降低(p<0.05)；而干扰对照组与癌痛组比较,无显著差异(p>0.05)。(2)Western Blot检测各组小鼠L4-6段脊髓的NR2B、p-ERK、p-p38和GFAP蛋白的表达：接种后第14、18天癌痛组小鼠脊髓的NR2B、p-ERK、p-p38和GFAP的蛋白表达比正常组明显上调(p<0.05)；干扰组NR2B、p-ERK、p-p38和GFAP的蛋白表达比癌痛组显著降低(p<0.05)；而干扰对照组与癌痛组比较,无显著差异(p>0.05)。结论：1.C57BL／6小鼠股骨骨髓腔接种Lewis肺癌细胞能成功制备小鼠骨癌痛新模型,此模型与人类骨癌痛具有相似性；2.NR2B在小鼠骨癌痛模型中呈高表达,且同一癌痛模型中观察到NR2B在L4-L6段脊髓和前扣带回同时高表达,提示在癌痛的产生和维持中不仅激活了脊髓低位中枢,而且有脑部中枢参与；3.本研究初次发现NR2B在癌痛模型的L4-6段脊髓前角细胞表达呈强阳性,为下一步研究提供了新的思路；4.PEI/NR2B-siRNA复合物能特异性的使骨癌痛小鼠脊髓NR2B的表达明显下调；其表达下调与小鼠疼痛行为学减轻相一致,进一步证明NR2B在骨癌痛发生过程中起重要作用；5.MAPK信号转导通路(ERK通路和p38通路)在骨癌痛小鼠模型中被激活；NR2B参与了MAPK信号通路介导的骨癌痛的中枢敏化；6.NR2B参与介导的骨癌痛可能与GFAP的过表达相关,其机制有待进一步研究。