目的:基于理论“整体观念与象思维”,运用网络药理学与转录组测序技术,初步构建化瘀祛痰方及其“益气-祛痰-化瘀“拆方抗AS机制的生信分析-效应分子网络,并结合实验验证,以期从现代生物学角度解析AS“虚痰瘀”病机及化瘀祛痰方的干预机制,为类似的中药复方研究及动脉粥样硬化的发病机制研究提供研究策略与实验依据。材料与方法:1.第一部分首先探讨“整体观念”对虚痰瘀论治AS指导作用,然后结合生信分析技术,以“象思维”构建中医病机与“生信分析—效应分子”网络,从现代生物学角度解析AS病机,为AS的诊断和治疗提供依据。2.第二部分借助TCMSP或BATMAN-TCM获得化瘀祛痰方的有效成分和作用靶点,Genecards和OMIM数据库获得疾病相关基因,采用Draw Venn Diagram在线程序将化瘀祛痰方和动脉粥样硬化的靶基因取交集,获得化瘀祛痰方与动脉粥样硬化的共同靶点;采用Cytoscape3.7.1绘制化瘀祛痰方成分、AS及靶基因的可视化网络图;通过String网站制作PPI可视化关系图;通过perl语言将关键基因提取,并制作连接度蛋白统计条图;利用R3.6.0软件进行GO和KEGG富集分析。3.第三部分C57BL/6J小鼠10只为正常对照组,喂养以普通小鼠饲料,Apo E-/-小鼠20只,随机分为模型组10只和化瘀祛痰方组10只,模型复制给予高脂饲料喂养进行,雌雄各半,饲养16周。于第13周开始,化瘀祛痰方组以含有生药量为0.91g/m L的中药煎剂灌胃,每次0.5m L,每日一次,正常对照组和模型组以等体积蒸馏水进行灌胃。在16周末禁食禁水24h,脱颈法处死小鼠,分离小鼠主动脉,一部分立即冷冻于液氮中备用,一部分剪切合适大小置于4%多聚甲醛溶液中待用。应用苏木精-伊红染色法观察各组小鼠主动脉的组织形态学变化。将采集到的三组主动脉送至上海天昊生物科技有限公司进行转录组测序。4.第四部分实验动物饲养、分组、造模、给药及标本采集同论文三。借助在线程序Draw Venn Diagram,将网络药理学筛选出的化瘀祛痰方治疗动脉粥样硬化潜在的239个靶点与转录组学中化瘀祛痰方组与模型组相比得到的1607个差异m RNA基因取交集分析;借助软件R3.6.0将交集基因结果,分别进行GO和KEGG富集分析;分析GO和KEGG富集结果,筛选出可能与动脉粥样硬化“虚、痰、瘀”中医病机相关的生物学过程、分子功能、信号传导通路等,初步构建以“象思维”为指导的“疾病—中医病机—生信分析—效应分子—成分—中药（拆方）—中医治法”网络;Elisa法检测各组小鼠主动脉PGE2含量变化;免疫组化检测各组小鼠主动脉组织PTGS2、FASN、PTGES、EGF、PAI-1表达情况;Realtime RT-PCR法检测各组小鼠主动脉PTGS2、AKT、FASN、PTGES、EP4、CCL2、EGF、PAI-1基因m RNA表达水平;Wes检测小鼠主动脉PTGS2、P-AKT、FASN、PTGES、EP4、CCL2、EGF、PAI-1蛋白表达水平。结果:1.第一部分通过探讨“整体观念与象思维”的虚痰瘀论治AS与“生信分析—效应分子”网络构建理论,为第二、三、四部分提供理论依据和研究思路。2.第二部分结果2.1化瘀祛痰方可能是通过多成分、多靶点、多种生物过程及信号通路共同发挥抗AS的作用。2.2获得药物活性成分113个,共预测出化瘀祛痰方可能作用靶点412个,动脉粥样硬化疾病相关基因3785个,化瘀祛痰方与动脉粥样硬化的共同靶点239个。2.3化瘀祛痰方抗动脉粥样硬化网络药理机制可能与脂质代谢、炎症反应、血管生成、氧化应激、凋亡等生物过程密切相关。2.4化瘀祛痰方防治动脉粥样硬化网络药理学机制可能与IL-17信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、HIF-1信号通路、TNF信号通路、细胞凋亡等信号通路密切相关。3.第三部分结果3.1 HE染色结果显示,正常对照组小鼠主动脉内膜厚度均匀,无脂质沉积,细胞排列整齐。模型组小鼠主动脉内膜增厚,脂肪空泡增多,泡沫细胞大量浸润。化瘀祛痰方干预后,小鼠主动脉内膜增厚减轻,脂肪空泡、泡沫细胞减少。3.2转录组差异m RNA表达结果表明,正常对照组与模型组相比,差异m RNA有2754个,其中上调基因有2162个,下调基因有592个;化瘀祛痰方组与模型组相比,差异m RNA有1607个,其中上调基因有572个,下调基因有1035个。3.3转录组特征分析研究显示化瘀祛痰方抗动脉粥样硬化作用机制可能与T细胞活化、脂质代谢、炎症反应、血管生成、氧化应激、凋亡等生物过程密切相关。3.4转录组特征分析研究显示化瘀祛痰方抗动脉粥样硬化作用机制可能与细胞因子-细胞因子受体相互作用、B细胞受体信号通路、细胞粘附分子、T细胞受体信号通路等信号通路密切相关。4.第四部分结果4.1转录组学与网络药理学交互分析显示将网络药理学与转录组学的差异基因取交集,得到34个交互靶基因。4.2转录组学与网络药理学交互分析显示化瘀祛痰方防治动脉粥样硬化作用机制可能与细胞对ATP的反应、凋亡过程的正调控、脂质代谢过程、血管生成、对血小板衍生生长因子刺激的细胞反应、炎症反应等生物过程密切相关。4.3转录组学与网络药理学交互分析显示化瘀祛痰方防治动脉粥样硬化作用机制可能与脂肪分解的调节、血管内皮生长因子信号通路、PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、钙信号通路、AMPK信号通路、胰岛素信号通路等信号通路密切相关。4.4初步构建以“整体观念与象思维”为指导的“疾病—中医病机—生信分析—效应分子—成分—中药（拆方）—中医治法”网络,进而更好的从现代生物学角度解析化瘀祛痰方及其“益气-祛痰-化瘀”拆方抗AS的中医病机。4.5 PTGS2/AKT/FASN信号通路Realtime RT-PCR结果显示:与正常对照组相比,模型组小鼠主动脉PTGS2、AKT和FASN基因m RNA水平显著升高（P＜0.01）,经药物干预后,化瘀祛痰方组小鼠PTGS2、AKT、FASN基因m RNA水平显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。Wes结果显示:与正常对照组相比,模型组小鼠主动脉FASN蛋白表达水平显著降低,PTGS2、P-AKT蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）,化瘀祛痰方组小鼠主动脉P-AKT蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）,FASN蛋白表达水平呈升高趋势,PTGS2蛋白表达水平呈下降趋势,但无统计学意义。免疫组化结果显示:与正常对照组相比,模型组小鼠主动脉PTGS2棕褐色颗粒表达显著增多,FASN棕褐色颗粒表达差异不显著;经药物干预后,化瘀祛痰方组小鼠主动脉PTGS2棕褐色颗粒数量表达显著减少,FASN棕褐色颗粒表达差异不显著。4.6 PTGS2/PTGES/PGE2信号通路Realtime RT-PCR结果显示:与正常对照组相比,模型组小鼠主动脉PTGS2、PTGES、EP4基因m RNA水平显著升高（P＜0.01）,经药物干预后,化瘀祛痰方组小鼠主动脉PTGS2、PTGES基因m RNA水平显著降低（P＜0.05）,EP4基因m RNA水平呈降低趋势,但无统计学意义。Elisa结果显示:与正常对照组相比,模型组小鼠主动脉PGE2含量显著升高（P＜0.01）,经药物干预后,化瘀祛痰方组小鼠主动脉PGE2含量显著降低（P＜0.01）。Wes结果显示:与正常对照组相比,模型组小鼠PTGS2蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）,PTGES、EP4蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）,经药物干预后,化瘀祛痰方组小鼠EP4蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）,PTGS2蛋白表达水平呈下降趋势,PTGES蛋白表达水平呈升高趋势,然而无统计学意义。免疫组化结果显示:与正常对照组相比,模型组小鼠主动脉组织PTGES棕褐色颗粒表达差异不显著;经药物干预后,化瘀祛痰方组小鼠主动脉组织中PTGES棕褐色颗粒表达差异亦不显著。4.7 Ccl2/EGF/PAI-1信号通路Realtime RT-PCR结果显示:与正常对照组相比,模型组小鼠主动脉CCL2、EGF、PAI-1基因m RNA水平显著升高（P＜0.05或P＜0.01）,经药物干预后,化瘀祛痰方组小鼠CCL2、EGF基因m RNA水平显著降低（P＜0.05）,其中,PAI-1基因m RNA水平呈下降趋势,但无统计学意义。Wes结果显示:与正常对照组相比,模型组小鼠主动脉CCL2、EGF、PAI-1蛋白相对表达水平显著升高（P＜0.01）,经药物干预后,化瘀祛痰方组小鼠主动脉CCL2、EGF、PAI-1蛋白相对表达水平显著降低（P＜0.01）。免疫组化结果显示:与正常对照组相比,模型组小鼠主动脉组织EGF、PAI-1黄褐色颗粒表达明显增多;经药物干预后,化瘀祛痰方组小鼠主动脉组织中EGF、PAI-1棕褐色颗粒数量显著减少。结论:1.化瘀祛痰方可减轻Apo E-/-动脉粥样硬化模型小鼠主动脉管壁斑块。2.化瘀祛痰方抗AS机制可能与脂质代谢、炎症反应、血管生成等生物过程有关。3.化瘀祛痰方抗AS机制可能与调控PTGS2/AKT/FASN、PTGS2/PTGES/PGE2、Ccl2/EGF/PAI-1信号通路上相关基因m RNA、蛋白表达有关。4.化瘀祛痰方可能是通过多成分、多靶点、多种生物过程及信号通路共同发挥抗AS的作用。