鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer, RA)为革兰氏阴性、短杆菌,是鸭、鹅、火鸡等禽类传染性浆膜炎(infectious serocitis, IS)的病原,存在至少21种血清型。类似于RA菌落形态和生化特征的细菌很多。根据16S rDNA将这些细菌归属于黄杆菌科(Flavobacterius)里默氏属(Riemerella),并细分为鸭疫里默氏菌种(Riemerella anatipestifer, RA)和哥伦比亚里默氏菌种(Riemerella columbina, RC)。鸭IS是鸭的常发病、多发病,8周龄内鸭高度易感,发病率为80%～100%,死亡率30%～70%。1、2、5等血清型是引起鸭IS主要流行血清型。虽然灭活疫苗和活疫苗可以有效地预防控制鸭IS流行,但是,目前我国养鸭场鸭IS流行仍然较为严重。如果我国政府进一步加大抗菌素药物在肉鸭养殖中的禁用力度,该病流行将会更加严重,养鸭业将蒙受巨大经济损失。究其原因有,不同血清型RA菌株缺乏交义免疫保护,灭活疫苗免疫诱导长(10-14天),血清型变异快,耐药性产生迅速等。本文报道RA抗体定量检测方法和耐过鸭血清被动免疫保护试验结果,旨在快速准确诊断流行血清型,为疫苗研制和使用提供监测技术,进一步明确鸭SI的免疫保护机制,为改进疫苗效果,尤其是研制可避免血清型差异的通用型疫苗提供基础理论依据。1AF株AF株系从鸭自然病例中分离的一株强毒力细菌,经玻板凝集鉴定为RA血清2型,16SrDNA和协同溶血素(cohemolysin, camp)基因PCR扩增产物1480bp和596bp,序列分析结果均证实属于RA,用于本研究。2.改良微量凝集试验可用于鸭SI快速诊断流行血清型凝集试验(agglutination test, AT)是经典免疫血清学技术。玻板AT广泛用于RA血清型定性鉴定。微量凝集(Microagglutination test, MAT)以96孔‘V’型PVC板为载体,主要用于RA血清抗体效价定量检测。常规MAT存在凝集与未凝集结果判定困难,检测结果敏感性不高等问题。改良MAT方法是,RA以兔血巧克力LB平板培养,生理盐水(PS)悬浮细菌,0.5%甲醛灭活,复红染色即制成MAT抗原。反应总体积为50μL。采取斜立近乎垂直观察‘下滑线’区别凝集与未凝集现象。改良MAT检测结果是,健康非免鸭76.5%个体抗体效价为0,其余为1log2；灭活疫苗免疫后14-22天血清抗体效价为2～5log2,70%个体为效价为2-3log2。攻毒后,疫苗免疫组无发病,但抗体效价于第2天上升1-2个滴度,即效价范围为2-5log2。未接种疫苗的攻毒对照组100%发病,有20%～90%的死亡率,攻毒后7天存活的耐过鸭效价范围为3～8log,超过5log2的个体比例占73.9%。研究结果提示,改良MAT背景值低于1log2,灭活疫苗免疫鸭效价低于5log2,而感染发病后的耐过鸭血清效价大于5log2的比例很高。据此提出,耐过鸭群检测MAT效价可以快速诊断流行的RA血清型。3.RA感染耐过鸭非凝集类抗体是主要免疫保护抗体22日龄易感鸭随机分为4组,分别注射健康鸭血清、RA感染耐过鸭血清、RA灭活疫苗免疫后攻毒发病耐过鸭(下简称免疫攻毒耐过鸭)血清和PS,每只3.0mL,24h后攻毒。结果是,PS组和健康鸭血清组100%发病,死亡率(mortality, Mt)分别为56%(5/9)和20%(1/5),耐过鸭血清组无发病、无死亡,免疫攻毒鸭血清组发病20%(1/5),无死亡。重复试验结果是,PS组和健康血清组100%发病,Mt为37.5%(5/14)和60%(3/5),耐过鸭血清组无发病、无死亡,免疫攻毒鸭血清组发病100%(5/5),无死亡。结果表明,RA感染耐过鸭血清具有良好的免疫保护效果。混合耐过鸭血清(MAT效价为5log2)56℃水浴30min处理、活菌菌体抗原吸附4-5次除去凝集抗体(MAT检测效价为0)并56℃水浴30min处理及稀释4倍(MAT检测为3log2)注射1mL/只(剂量为其他组的1/3)发病率分别为0、0和22.2%(2/9),Mt均为0,即无死亡。同时设置的PS组和健康鸭血清组100%发病,Mt为33.3%(3/9)和0%。结果显示,RA耐过鸭血清中的非凝集性抗体为主要保护性抗体,且生物活性高,不受56℃水浴30min影响。MAT效价与被动免疫保护效果存在间接相关性。4.AF株生长凝集-解凝集生长现象RA耐过鸭血清(MAT效价为6log2)无菌检验合格后,取100μL加入1.9mL LB肉汤中,培养AF株。观察到,接种后2h,出现小的絮状凝集块,溶液透明,4-5h凝集块最多,呈大片状,溶液透明,5-6h凝集块开始解散,溶液变乳白色,6-7h后凝集块完全消失,溶液浑浊快速增加。测定A525值发现,凝集块消散后,数值呈对数增加,至12h达最大值,即2.2以上。凝集块的出现与MAT效价有关，低于4log2的血清试管，凝集块模糊。健康鸭血清对照组未见凝集块出现,但细菌生长至12h时,A525也达峰值。无鸭血清的LB组,细菌生长缓慢,A525峰值出现在24h左右。结果表明,耐过鸭血清组出现的凝集块具有特异性,鸭血清对RA的生长具有促进作用。本文将RA一边生长并同时与抗体发生特异凝集反应,之后凝集块消散,细菌快速生长现象归纳为生长凝集-解凝集生长(growth agglutination and deagglutination growth,GADAG)现象。RA发生这一新现象的机制尚待研究。GADAG过程中细菌镜检形态发生变化。在凝集期,AF株聚集成块,菌体形态变短,几近球形。凝集块消散后,菌体呈散在分布,形态恢复短杆状。GADAG培养RA菌液,A525值为0.85±0.05时人工接种26日龄易感鸭。结果是,培养6h,剂量为0.7mL/只组Mb和Mt为45%和13.4%,20h组依次为100%和71.5%,与无鸭血清的兔血巧克力LB平板培养菌悬液组差异不显著。结果表明,GADAG未对RA毒力产生不良影响。