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氨基甲酸乙酯是一种广泛存在于发酵食品中的有害物质,它的存在严重影响了我国传统发酵食品的安全性。尿素是黄酒中氨基甲酸乙酯生成最重要的前体物质之一,降低发酵末期黄酒中尿素的含量对于黄酒中氨基甲酸乙酯含量的降低具有重要意义。本文通过模式菌株研究氮代谢阻遏调控因子、精氨酸转运途径和尿素转运蛋白Dur3p泛素化对酿酒酵母发酵末期尿素生成的影响,酿酒酵母整体核小体排布与氮代谢阻遏相关基因表达的关联。并进一步通过适应性进化和高通量筛选相结合的方法筛选低产尿素的酿酒酵母菌株,主要结论如下:(1)酿酒酵母非偏好性氮源尿素的代谢受到氮代谢阻遏效应的调控,而氮代谢阻遏效应对酿酒酵母氮源次序利用的调控主要依赖于4个转录因子Gln3p、Gat1p、Dal80p、Gzf3p。在营养丰富的培养基中,发酵末期尿素的积累受到Gln3p和Gat1p正调控,Dal80p和Gzf3p的负调控。敲除GZF3基因可使发酵末期尿素生成量降低18.7%。过量表达GLN3和GAT1基因不能有效降低发酵末期的尿素生成,而过量表达DAL80和GZF3基因则会增加发酵末期尿素的生成。过量表达截断的GLN3和GAT1基因,能有效降低发酵末期尿素生成,但其对尿素代谢增强的效果依赖GLN3、GAT1和DAL80基因功能的完整性。GZF3基因敲除则能进一步增强过量表达截断GLN3和GAT1基因对发酵末期尿素含量的降低效果。(2)酿酒酵母中尿素来源于精氨酸的直接降解,而精氨酸转运蛋白在调控精氨酸利用和尿素生成过程中发挥重要的作用。通过组合敲除3种精氨酸转运蛋白基因ALP1、GAP1、CAN1发现,在精氨酸为氮源条件下,CAN1基因敲除对精氨酸利用的抑制最严重,GAP1基因敲除次之,而ALP1基因敲除无明显影响。在同等生长条件下,过量表达ALP1基因比CAN1基因更有利于酿酒酵母对精氨酸的利用。三种精氨酸转运蛋白基因对自身基因表达和精氨酸代谢相关基因的表达可能存在协同调控机制。精氨酸转运蛋白基因的组合敲除显示,相对于野生型菌株,双敲除GAP1和CAN1基因后,酿酒酵母发酵末期的尿素含量下降了68.4%。(3)酿酒酵母尿素转运蛋白Dur3p在尿素转运和代谢过程中扮演着重要的角色。通过对尿素转运蛋白Dur3p泛素化位点的预测,发现其第556位和第571位赖氨酸是可信度较高的泛素化位点,在此基础上,对这些泛素化位点进行组合突变。在YNB添加尿素培养基中加入偏好性氮源谷氨酰胺后,Dur3p的泛素化水平提升了95.8%。在YNB添加尿素培养条件下,相对于Dur3p,Dur3p571R的泛素化水平下降14.3%。在YNB培养基中同时添加尿素和谷氨酰胺,相对于Dur3p,Dur3pK556R突变的泛素化水平下降了16.2%。相对于Dur3p,过量表达Dur3p泛素化位点突变体对酿酒酵母的生长没有显著的影响,但是能显著降低发酵末期尿素的含量。在Δdur3菌株中,相比于Dur3p,过量表达Dur3pK556R和Dur3pK571R突变体后,发酵末期尿素含量分别下降75.8%和28.3%。(4)酿酒酵母核小体排布与基因的转录调控密切相关。通过高通量测序技术分析在不同氮源条件下,酿酒酵母基因组上整体的核小体排布,发现不同氮源条件影响整体的核小体排布和氮代谢阻遏(NCR)相关基因的表达。此外TATA-containing基因的核小体排布丰度明显高于TATA-less基因。在高核小体和低核小体排布情况下,相对于谷氨酰胺条件下,由谷氨酰胺培养条件下转移到脯胺酸培养条件后,TATA-less基因编码区域的核小体排布丰度有显著的升高。核小体预测激活的NCR相关基因,大部分基因的表达水平都上调,而核小体预测抑制的NCR基因,基因的表达和核小体预测之间并没有显著的相关性。(5)基于酿酒酵母尿素代谢机制研究,发现增强酵母的尿素代谢能力有助于降低发酵末期尿素的积累。应用适应性进化策略持续刺激酿酒酵母N85单倍体菌株尿素代谢能力的进化,并结合高通量筛选获得一株低产尿素的适应性进化突变菌株。和野生菌相比,突变菌株发酵末期尿素含量下降了16.8%。在此基础上,对突变菌株进行全基因组测序和比较基因组学分析,发现进化菌株存在170个潜在的突变位点,有27个基因的64个氨基酸位点发生突变。通过进一步的重测序验证和对这些基因潜在功能的分析,发现ESL2基因可能和发酵末期尿素的降低有关。敲除N85单倍体的ESL2基因后发现,和野生菌菌株相比,Δesl2菌株发酵末期尿素含量下降了12.8%。