背景恶性肿瘤已经成为人类健康的重大威胁。流行病学研究显示,近年来我国恶性肿瘤发病率和致死率在不断升高。在临床上,肿瘤的治疗主要以手术、化疗、放疗或这些手段联合为主。但是,肿瘤患者、特别是晚期患者的预后没有显著改善,因此更加有效的肿瘤治疗手段亟待发展。经过一个多世纪的发展,免疫治疗展示出强大的抗肿瘤潜力并且已经在临床肿瘤治疗中显示了良好效果。例如,嵌合抗原受体T(chimeric antigenreceptorT,CAR-T)细胞治疗和免疫检查点阻断抗体(immune checkpoint blockade,ICB)分别在部分类型血液和实体肿瘤患者治疗取得成功,极大提高了患者5年生存率。但是,这些以T细胞为基础的免疫治疗技术仅在少数患者中有效,特别是在实体肿瘤患者中有效率更低。有研究显示,实体瘤微环境与T细胞之间的相互作用是影响免疫治疗疗效的关键因素。实体瘤微环境中存在众多免疫抑制分子,例如PDL1、CTLA-4、IDO等,其中PDL1被认为是抑制T细胞活性的关键分子。PDL1能够活化T细胞上PD-1进而抑制T细胞的肿瘤杀伤活性。理论上,靶向PDL1或PD-1的阻断抗体治疗能够有效改善肿瘤治疗。实际上,仅有少量患者从阻断治疗中获益,除了 PDL1外,靶向CTLA-4、IDO或其他T细胞抑制因素的治疗也均不能在多数患者中取得有效反应。临床前研究显示,环境因素能够导致T细胞自身代谢改变,进而影响T细胞响应阻断治疗的反应性和肿瘤治疗效果。因此,改善T细胞免疫治疗的前提是深入了解免疫抑制因素与T细胞代谢之间的相关作用以及其对阻断治疗的影响,从而发现关键代谢分子以研发更加有效的联合治疗策略。基于上述思考,本课题主要研究肿瘤微环境中T细胞脂类代谢的改变、脂类代谢对T细胞功能的影响,以及PDL1/PD-1通路与T细胞脂类代谢之间的联系,利用细胞模型、动物模型和临床标本等深入分析了 T细胞代谢对其功能的影响以及作用机制。第一部分 实体瘤肿瘤微环境中CD8+T细胞磷脂代谢降低目的探讨实体肿瘤微环境中CD8+T细胞脂类分子代谢变化,以及脂类代谢与T细胞功能之间的相关性。方法(1)通过流式细胞术,对比肺癌患者外周血和肿瘤组织中活化CD8+T细胞表达共抑制分子(PD-1、CTLA4和Tim3)、功能分子(GranzymeB和IFN-y)以及增殖相关分子Ki67的差异;(2)通过超高效液相色谱技术检测肺癌患者外周血和肿瘤组织中活化CD8+T细胞中脂类分子类型和丰度;通过RT-PCR、流式细胞术和细胞免疫荧光技术检测肿瘤患者外周血和肿瘤组织中活化CD8+T细胞磷脂代谢相关酶PLPP1的表达;(3)基于公共数据库中36例非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)患者的肿瘤浸润CD8+T细胞测序数据,分析PLPP1表达与信号通路以及T细胞功能分子的相关性;(4)通过在线工具(tumor immune dysfunction and exclusion),分析 CD8+T细胞浸润和PLPP1表达对肿瘤患者预后的影响。结果(1)通过对肺癌患者外周血和肿瘤组织中活化CD8+T细胞的分析,发现PD-1、CTLA4和Tim3在肿瘤组织中的表达水平较高,而GranzymeB、IFN-γ和Ki67表达水平较低,提示CD8+T细胞在肿瘤微环境中受到抑制;(2)通过超高效液相色谱技术分析发现,不同组织来源的活化CD8+T细胞中脂类分子丰度不同。在肿瘤组织中,CD8+T细胞有较高丰度的磷脂酸(phosphatidicacid,PA)和较低丰度的甘油二酯(diacylglycerol,DG),磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE),提示CD8+T细胞中磷脂分子的合成能力减弱;(3)通过代谢通路分析发现PLPP1是T细胞磷脂代谢改变的关键酶。进一步分析发现,PLPP1在肿瘤浸润CD8+T细胞中的表达显著低于外周血。因此,我们接下来的研究重点分析PLPP1对T细胞的影响;(4)根据PLPP1表达水平对NSCLC患者CD8+T细胞测序数据进行分组后,发现PLPP1高表达患者中肿瘤浸润T细胞DNA复制、细胞分裂、氧化磷酸化、脂肪酸代谢以及IFN-γ反应相关信号通路较为活跃,提示PLPP1可能参与并调控细胞的增殖,代谢及功能;(5)测序数据还提示PLPP1表达与组织常驻记忆(residentmemoryTcell,Trm)细胞数量、T细胞活化水平及功能正相关;(6)对直肠癌和食管癌患者外周血和肿瘤组织中的活化CD8+T细胞分析,发现PLPP1表达在肿瘤组织中明显低于外周血,进一步提示PLPP1可能在多种实体肿瘤中的表达均降低;(7)对多种实体肿瘤患者CD8+T细胞分析,发现PLPP1表达水平与肿瘤浸润CD8+T细胞数量正相关,提示PLPP1高表达可能能够增加肿瘤微环境中T细胞的浸润及肿瘤杀伤能力。结论实体肿瘤患者中,肿瘤浸润CD8+T细胞的脂类代谢水平受到抑制,其中磷脂代谢相关酶PLPP1与T细胞在肿瘤部位的浸润水平和活化程度紧密相关。PLPP1表达下调是T细胞脂类代谢改变的关键酶。第二部分PLPP1调控CD8+T细胞的功能及代谢目的探讨PLPP1敲低后对活化的CD8+T细胞代谢及功能的直接影响。方法(1)通过流式细胞术,对比分析肺癌肿瘤组织部位PLPP1低表达和高表达的CD8+T细胞中功能分子(IFN-γ和TNF-α)的差异;同时构建恶性黑色素瘤小鼠模型,通过流式细胞术再次对比分析小鼠肿瘤组织部位PLPP1低表达和高表达的CD8+T细胞中功能分子(IFN-γ)和增殖相关分子(Ki67)的差异;(2)通过分子克隆技术构建PLPP1-sh质粒,转染健康人外周血来源的活化后的CD8+T细胞,并通过流式细胞术和RT-PCR法检测敲低效率,最后通过超高效液相色谱技术检测活化后的CD8+T细胞以及PLPP1-sh1和PLPP1-sh2CD8+T细胞中脂类分子类型和丰度;(3)通过RT-PCR法和海马能量检测技本分别检测活化后的CD8+ T细胞以及PLPP1-sh1和PLPP1-sh2 CD8+T细胞中代谢通路相关酶的表达,以及ECAR和OCR的代谢速率;(4)通过流式细胞术检测活化后的CD8+ T细胞以及PLPP1-sh1和PLPP1-sh2 CD8+T 细胞的增殖、凋亡、功能以及胞内 Ca2+浓度。结果(1)通过对比分析肺癌肿瘤组织部位PLPP1高表达和低表达的CD8+T细胞的功能,发现与PLPP1低表达的CD8+T细胞相比,PLPP1高表达的CD8+T细胞的功能较高;同时小鼠恶性黑色素瘤组织部位PLPP1高表达的CD8+T细胞的功能和增殖能力也明显高于PLPP1低表达的细胞;(2)CD8+T细胞活化后PLPP1的表达升高,通过分子克隆技术敲低活化的CD8+T细胞中PLPP1的表达,并对比分析PLPP1敲低后CD8+T细胞的代谢过程,发现PLPP1敲低后CD8+T细胞整体代谢水平均下调,其中磷脂代谢、糖酵解和脂肪酸合成代谢通路下调较为明显;(3)与对照组CD8+T细胞(未转染)相比,PLPP1-sh1和PLPP1-sh2CD8+T细胞凋亡比例没有明显变化,但是T细胞的增殖能力、杀伤功能和胞内Ca2+浓度均降低。PLPP1敲低后CD8+T细胞凋亡不受影响,但是T细胞增殖能力降低。结论PLPP1下调能够降低CD8+T细胞的磷脂代谢、糖酵解和脂肪酸合成代谢通路,并导致T细胞增殖、功能以及胞内Ca2+浓度下降,是调控CD8+T细胞代谢和功能的关键分子。第三部分PDL1/PD-1结合降低CD8+T细胞中PLPP1的表达目的探讨肿瘤微环境中调控CD8+T细胞中PLPP1表达的关键分子。方法(1)体外将健康人外周血来源的活化的CD8+T细胞与肺癌肿瘤细胞系H460和A549共孵育,通过RT-PCR和流式细胞术检测共孵育后T细胞中PLPP1的表达,以及T细胞表面PD-1和肿瘤细胞表面PDL1的表达;(2)通过流式细胞术检测肺癌患者肿瘤组织中PLPP1高表达和低表达的活化CD8+T细胞表面共抑制分子(PD-1、CTLA4和Tim3)的表达差异;(3)体外活化健康人外周血来源的CD8+T细胞,并使用PDL1 Fc片段处理T细胞,通过成像流式和流式细胞术检测PDL1 Fc处理后CD8+T细胞PLPP1的表达;(4)通过分子克隆和细胞转染技术获得PLPP1敲低的CD8+T细胞,并使用PDL1 Fc片段处理,通过海马能量检测技术和流式细胞术检测PDL1 Fc处理后CD8+T细胞以及PLPP1-sh1和PLPP1-sh2 CD8+T细胞中OCR的代谢速率,细胞内线粒体功能变化,以及细胞功能和胞内Ca2+浓度变化;(5)构建小鼠恶性黑色素瘤模型并过继回输OT1T细胞,回输T细胞后分别在不同的时间点给予PDL1阻断型单抗治疗,通过RT-PCR和流式细胞术检测PDL1阻断型单抗治疗后小鼠肿瘤组织中CD8+T细胞的功能,以及PD-1高表达和不表达的CD8+T细胞中PLPP1的表达。结果(1)在肺癌患者的肿瘤微环境中发现PLPP1高表达的CD8+T细胞表面PD-1表达较低,而PLPP1低表达的CD8+T细胞中PD-1表达较高,这表明PD-1分子有可能调控CD8+T细胞中PLPP1的表达;(2)健康人外周血来源的活化的CD8+T细胞与肺癌肿瘤细胞系H460和A549直接或间接共孵育,通过流式细胞术发现直接共孵育体系中CD8+T细胞表面PD-1的表达和肿瘤细胞系表面PDL1的表达显著升高,且该体系中CD8+T细胞中PLPP1的表达明显低于未孵育或间接共孵育的CD8+T细胞,该结果进一步表明了 PD-1可能调控CD8+T细胞中PLPP1的表达;(3)体外使用PDL1 Fc片段处理活化的CD8+T细胞以及PLPP1-sh1和PLPP1-sh2 CD8+T细胞,发现PDL1 Fc片段处理CD8+T细胞后细胞内OCR的代谢速率、胞内线粒体功能以及细胞功能和胞内Ca2+浓度均降低,但是处理PLPP1-sh1和PLPP1-sh2CD8+T细胞中OCR的代谢速率、胞内线粒体功能以及细胞功能和胞内Ca2+浓度没有明显变化,这表明PDL1/PD-1调控CD8+T细胞的代谢和功能主要依赖T细胞中PLPP1的表达;(4)PDL1阻断型单抗治疗小鼠恶性黑色素瘤后能够降低肿瘤细胞的生长速度,且进一步发现能够提高肿瘤微环境中抗原特异性T细胞中PLPP1的表达以及功能。结论肿瘤微环境中CD8+T细胞表面PD-1与其配体PDL1结合后,细胞内PLPP1的表达降低,进而导致T细胞代谢和功能的降低。第四部分PDL1/PD-1调控CD8+T细胞中PLPP1表达的分子机制目的探讨肿瘤微环境中PDL1/PD-1调控CD8+T细胞中PLPP1表达的主要信号通路。方法(1)体外使用PDL1 Fc处理健康人外周血来源的活化的CD8+T细胞以及Jurkat和Jurkat-PD1细胞系,通过流式细胞术和Western blot技术检测PDL1 Fc处理后这些细胞中AKT/mTOR信号通路的变化;(2)通过PCR array和网站预测分析PDL1 Fc处理后健康人外周血来源的CD8+T细胞中转录因子的变化,同时通过体外敲低CD8+T细胞中相关转录因子检测细胞中PLPP1的表达变化;(3)通过Chip技术检测转录因子GATA1与靶基因PLPP1上游启动子区的结合,并进一步通过双荧光素酶实验验证GATA1是否能够与PLPP1的启动子区结合,从而调控该基因的表达;(4)GATA1调控目的基因的表达需要入核来发挥功能,通过成像流式和Western blot技术检测PDL1 Fc处理后CD8+T细胞中GATA1的核转位;(5)构建小鼠恶性黑色素瘤模型并过继回输OT1T细胞,通过小鼠成像技术检测肿瘤的生长并通过H&E染色证明肿瘤的生成;通过组织免疫荧光检测PDL1阻断型单抗治疗后小鼠的肿瘤组织中CD8+T细胞的浸润以及PLPP1的表达;通过流式细胞术检测PDL1阻断抗体治疗后小鼠的肿瘤组织抗原特异性T细胞中AKT/mTOR信号通路的变化。结果(1)与Jurkat细胞系相比,Jurkat-PD1细胞系经过PDL1 Fc处理后AKT/mTOR信号通路受到明显抑制,同时PDL1 Fc片段处理健康人外周血来源的活化的CD8+T细胞后,T细胞中AKT/mTOR信号通路的活化也受到抑制,且PLPP1的表达降低;(2)CD8+T细胞经过PDL1 Fc片段处理后,细胞内共有14个转录因子发生变化,同时通过PROMO预测PLPP1启动子区的转录因子,最终发现差异转录因子中有5个可能调控PLPP1的转录因子(其中有2个转录因子在T细胞中表达水平很低,因此在后续实验中排除),进一步通过敲低这些转录因子的表达发现GATA1是最有可能调控PLPP1表达的转录因子;(3)通过Chip实验发现GATA1能够与PLPP1启动子区的两个位点结合,且AKT抑制剂能够促进GATA1与PLPP1启动子区的结合,但是双荧光素酶实验发现GATA1只能够通过与PLPP1启动子区的site2位点结合,从而降低PLPP1的表达;(4)小鼠恶性黑色素瘤模型中PDL1阻断型单抗治疗后能够再次激活肿瘤组织部位CD8+T细胞中AKT/mTOR信号通路,从而提高肿瘤微环境中PLPP1+CD8+T细胞的浸润,降低肿瘤细胞的生长速度。结论PDL1/PD-1主要通过抑制CD8+T细胞中AKT/mTOR信号通路的活化,从而促进GATA1的核转位,最终导致PLPP1表达降低。