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水稻是世界上最重要的粮食作物之一，是全球超过一半人口的主要食物和能量来源。如何提高水稻产量、改善质量是农业科学家们研究的重点。目前水稻高产主要依赖化学肥料和农药的使用，伴随而来的是生态环境的恶化。本研究以课题组发现的来源于土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ag39的新型固氮酶基因nifT44为基础，从新筛选的内生固氮菌中克隆到该基因并构建其植物表达载体，运用农杆菌介导法转化水稻，初步建立了高效转化体系。研究结果如下： 1、固氮菌株的筛选及固氮酶基因nifT44克隆：从本实验室固氮菌库中选取22株内生固氮菌，采用全氮比色法和乙炔还原法筛选出10株高固氮酶活性的内生固氮菌，进行nifT44基因的扩增，其中阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)Y3208和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)XS43成功扩增出约780 bp的nifT44基因。 2、水稻表达载体的构建：采用TOPO克隆将nifF44基因导入pENTR/SD/D-TOPO载体，构建pENTR/SD/D-nifT44，转化大肠杆菌(Escherichia Coli)DH5α，经测序鉴定后，用限制性内切酶nhe I线性化，经LR重组反应，构建融合GFP的植物表达载体nifT44-pMDC43，运用冻融法将其转化农杆菌GV3101。 3、以粳稻中花14号为植物材料，经过多次重复试验，最终建立了粳稻中花14号的高效遗传转化体系。优化的体系为：用YEB液体培养基活化农杆菌，侵染时调节菌液浓度OD6000.08，放入摇床中振荡10 min，然后静止静止5 min；在菌液和培养基中都添加150μM乙酰丁香酮(As)，共培养基pH5.3；为防止愈伤褐化褐化，共培养后洗菌时用含有0.1％柠檬酸的无菌水处理，然后干燥24 h；选择培养基中添加浓度为150 mg/L的头孢曲松钠能够很好的抑制农杆菌的生长；在预分化培养基中添加5 mg/L脱落酸(ABA)。以绿色荧光蛋白(GFP)作为筛选标记，比传统的GUS染色更为高效、快速。 4、转基因植株的鉴定和nifT44在水稻内的表达分析：将筛选到的13株潮霉素抗性苗进行PCR鉴定，最终获得4株阳性T0代植株。用改良丙酮法提取水稻可溶性蛋白，经SDS-PAGE法检测，结果表明，阳性植株在47 kDa处有明显条带，而对照株没有条带，初步证明nifT44基因在水稻内表达。