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研究背景和目的： 近几年,结肠癌的发病率越来越高，而现有治疗效果有限。目前非常需要研发新的药物，寻找新的治疗方案。近年，分子靶向治疗已成为肿瘤治疗的趋势。目前，结肠癌常用的靶向药物有贝伐单抗、西妥昔单抗等，临床治疗通常采用联合治疗，即化学治疗联合靶向药物治疗，取得了一定的疗效。神经纤毛蛋白-2（Neuropilin-2，NRP-2）在结肠癌细胞中高表达，它的配体和受体较多，如VEGF和VEGFR、Semaphorin和Plexins、TGF-β和TGFR、HGF和c-met，参与细胞多种信号通路的传导，在肿瘤血管和淋巴管的形成、肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭等生物行为中发挥重要作用。因此，NRP-2很可能成为未来肿瘤治疗的一个新靶点。本文旨在制备靶向 NRP2-b1b2片段的单克隆抗体，然后以结肠癌为例，探讨NRP2mAb在肿瘤治疗中的应用前景。 实验方法： 本实验室在前期已经构建出了3株可稳定分泌靶向NRP2-b1b2mAb的杂交瘤细胞株C3、E4、E8。本实验以杂交瘤细胞株C3为例，将其扩大培养后，注入小鼠腹腔中，后取腹水，腹水即含有大量NRP-2mAb。通过rProtein A亲和柱纯化抗体，后装入透析袋中透析，冻干机上冻干；然后，SDS-PAGE电泳分析抗体的纯度、浓度；间接ELISA鉴定抗体的活性。采用流式细胞术、Western blotting、细胞免疫荧光、免疫组织化学染色实验分别检测制备的NRP-2 mAb与结肠癌细胞和结肠癌组织中NRP2蛋白的结合情况。CCK8实验、凋亡实验、Transwell实验检测NRP2抗体对结肠癌细胞生物学行为的作用。Western blotting检测凋亡相关蛋白及增殖相关蛋白变化，分析NRP2抗体对Bcl-2/Bax/Caspase-3、PI3K/Akt、MEK/ERK等信号通路的影响，探讨NRP2抗体的抗肿瘤机制。 实验结果： 结果证明，制备的NRP-2 mAb纯度高、亲和力好，浓度约为1mg/mL，效价约为1×10-6。Western blotting实验显示4株结肠癌细胞提取的总蛋白在130KDa左右处有一条清晰的条带，说明结肠癌细胞中有NRP-2表达，其中SW480细胞表达最高。流式细胞术、细胞免疫荧光实验结果表明，结肠癌细胞中 NRP-2抗原表达阳性，且主要表达于细胞膜。免疫组化结果显示，与正常组织、癌旁组织相比，NRP-2在结肠癌中的表达明显上调。同时，不同病理学分级及不同肿瘤分期的结肠癌组织染色结果有差异。CCK8实验、凋亡实验、Transwell实验说明NRP-2 mAb可明显抑制结肠癌SW480细胞的增殖、迁移、侵袭，促进细胞凋亡。Western blotting实验检测到NRP-2mAb作用于结肠癌细胞后，蛋白Caspase-3、Bax的表达明显上调，而Bcl-2、PI3K、p-ERK、p-AKT的表达明显下调，说明NRP-2 mAb的抗肿瘤机制可能与MEK/ERK、Bcl-2/Bax/Caspase-3、PI3K/Akt信号通路有关。 结论： 1.本实验制备的NRP-2 mAb纯度高、亲和力好。 2. NRP-2 mAb能够很好地与结肠癌细胞和组织中NRP2蛋白特异性结合。 3. NRP-2 mAb可明显抑制结肠癌SW480细胞增殖、迁移、侵袭，促进细胞凋亡。 4.NRP-2 mAb对结肠癌细胞的抗肿瘤机制与MEK/ERK、Bcl-2/Bax/Caspase-3、PI3K/Akt信号通路有关。