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目的阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是一种病因复杂的慢性进行性中枢神经系统变性病导致的痴呆,其特点是进行性认知功能下降、记忆障碍,甚至出现人格行为改变等。AD具有多种病理改变,除了典型的Aβ沉积形成的老年斑、过度磷酸化tau蛋白形成的NFTs,髓鞘损伤和突触丢失也与AD密切相关,尤其是在AD早期。进一步研究发现:髓鞘损伤早于认知障碍、SPs沉积和NFTs病理改变,提示髓鞘损伤可能在AD早期认知障碍中发挥关键作用。研究发现PI3K/Akt-mTOR信号通路是调控髓鞘形成的重要信号通路之一,它不仅从促进少突胶质细胞分化的角度调控髓鞘形成,还通过调控蛋白质合成和脂质合成参与调节髓鞘的合成过程。因此,本研究主要以AD早期髓鞘和突触的损伤与认知障碍密切相关为切入点,从功能性脑回路,包括少突胶质细胞、髓鞘、神经突触和神经元的角度,旨在通过观察参枝苓口服液对APP/PS1小鼠学习记忆能力的影响,对海马突触、髓鞘及少突胶质细胞的影响,以及对PI3K/Akt-mTOR信号通路相关蛋白和髓鞘、突触相关蛋白表达的影响,初步探讨参枝苓口服液在AD早期对髓鞘和突触的保护作用及潜在机制,为参枝苓口服液在AD早期发挥治疗作用提供实验依据。材料和方法1 75只SPF级3月龄雄性APP/PS1小鼠随机分为模型组、多奈哌齐组、参枝苓大剂量组、参枝苓中剂量组、参枝苓小剂量组,每组15只;15只同窝SPF级3月龄雄性C57/BL6J小鼠作为正常对照组。先进行3天适应性喂养,然后开始灌胃对应药物进行治疗3个月。2通过Morris水迷宫实验观察参枝苓口服液灌胃3个月后对APP/PS1小鼠行为学的影响,评价参枝苓口服液对APP/PS1小鼠学习记忆能力的影响。3采用透射电镜观察参枝苓口服液对APP/PS1小鼠海马突触、髓鞘、少突胶质细胞和神经元的影响。4采用LuxolFastBlue髓鞘染色(伊红法)观察参枝苓口服液对APP/PS1小鼠脑髓鞘的影响。5采用免疫组化、western-blot和RT-PCR的方法观察APP/PS1小鼠海马PI3K/Akt-mTOR信号通路相关蛋白PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR和髓鞘相关蛋白MBP、突触相关蛋白PSD95的表达,评价参枝苓口服液对PI3K/Akt-mTOR信号通路和髓鞘相关蛋白、突触相关蛋白的影响。实验结果1参枝苓口服液对APP/PS1小鼠行为学的影响Morris水迷宫实验显示,从第1天至第5天,模型组逃避潜伏期与正常组小鼠相比显著延长(P<0.01);第3天,参枝苓中剂量组与模型组小鼠相比潜伏期明显缩短(P<0.05);第4天开始,与模型组相比,多奈哌齐组,参枝苓大、中、小剂量组小鼠潜伏期均缩短(P<0.05),其中参枝苓中剂量组缩短较为显著(P<0.01)。从第2天至第5天,模型组游泳距离与正常组小鼠相比显著延长(P<0.01);第3天,参枝苓中剂量组,小剂量组与模型组相比,游泳距离明显减少(P<0.05);第4天开始,与模型组相比,多奈哌齐、参枝苓大、中、小剂量组游泳距离减少(P<0.05),其中参枝苓中、小剂量组减少较为显著(P<0.01)。撤台实验结果显示与正常组小鼠相比,模型组小鼠在目标象限停留时间和穿越平台次数明显减少,差异具有显著性(P<0.01)。与模型组相比,多奈哌齐和参枝苓中、小剂量组目标象限停留时间和穿越平台次数明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。2参枝苓口服液对APP/PS1小鼠海马CA1区少突胶质细胞、髓鞘和突触形态的影响电镜观察正常组髓鞘板层结构比较完整,模型组小鼠海马区髓鞘板层结构出现明显损坏;而各药物组小鼠海马区髓鞘板层结构均较模型组明显好转,其中以多奈脈齐组和中、小剂量组最为显著。髓鞘固蓝染色(Luxol Fast Blue)后髓鞘白质纤维呈深染的蓝色,正常组小鼠可见稠密分布的髓鞘白质纤维。模型组蓝色的髓鞘纤维显著减少,染色明显变淡,反映了小鼠脑内髓鞘的丢失。与模型组相比,多奈哌齐组和参枝苓大、中、小剂量组髓鞘纤维分布均明显增加,染色加深。电镜下观察正常组的少突胶质细胞基本正常,结构完整、核膜连续、核染色质分布均匀;模型组少突胶质细胞呈凋亡前状态,出现核膜不连续,核染色质浓缩;参枝苓大、中、小组剂量组少突胶质细胞较模型组均有所改善,染色质分布较为均匀。电镜下观察神经毡中突触数量。与正常组相比,模型组小鼠海马CA1区突触数量显著减少(P<0.01);而各药物治疗组小鼠海马CA1区突触数量均多于模型组,其中以多奈哌齐组和参枝苓中剂量最为显著(P<0.01)。3参枝苓口服液对APP/PS1小鼠PI3K/Akt-mTOR通路及髓鞘、突触相关蛋白的影响Western-blot结果显示,与正常组相比,模型组PI3K蛋白表达减少,但无统计学差异(P>0.05);与模型组相比,多奈哌齐组和参枝苓组(大、中、小剂量)PI3K蛋白表达均增加,但无统计学差异(P>0.05)。免疫组织化学染色结果显示,与正常组相比,模型组小鼠海马区PI3K阳性细胞数明显减少(P<0.01);与模型组相比,多奈哌齐组、参枝苓中、小剂量组小鼠海马PI3K阳性细胞表达均增加(P<0.05)。Western-blot结果显示,与正常组相比,模型组Akt蛋白表达明显减少(P<0.05);与模型组相比,多奈哌齐组和参枝苓组(大、中、小剂量)Akt蛋白表达均增加,其中以多奈哌齐组和参枝苓中剂量组和小剂量组显著(P<0.05)。免疫组织化学染色结果显示,与正常组相比,模型组小鼠海马区Akt阳性细胞数显著减少(P<0.01);与模型组相比,多奈哌齐组、参枝苓大、中、小剂量组小鼠海马Akt阳性细胞数均明显增加(P<0.01)。Western-blot结果显示,与正常组相比,模型组p-Akt蛋白表达明显减少(P<0.01);与模型组相比,多奈哌齐组和参枝苓组(大、中、小剂量)p-Akt蛋白表达均增加(P<0.01)。Western-blot结果显示,与正常组相比,模型组mTOR蛋白表达明显减少(P<0.01);与模型组相比,多奈哌齐组和参枝苓组(大、中、小剂量)mTOR蛋白表达均增加(P<0.01)。免疫组织化学染色结果显示,与正常组相比,模型组小鼠海马区mTOR阳性细胞数明显减少(P<0.01);与模型组相比,多奈哌齐组、参枝苓大、中、小剂量组小鼠海马mTOR阳性细胞数均显著增加(P<0.01)。Western-blot结果显示,模型组p-mTOR蛋白表达比正常组明显减少(P<0.01);与模型组相比,多奈哌齐组和参枝苓组(大、中、小剂量)p-mTOR蛋白表达均增加,其中以多奈哌齐组、参枝苓中剂量和小剂量组明显增加(P<0.01)。Western-blot结果显示,模型组MBP蛋白表达比正常组明显减少(P<0.01);与模型组相比,多奈哌齐组和参枝苓组(大、中、小剂量)MBP蛋白表达均增加,其中以参枝苓中、小剂量组明显增加(P<0.01)。Western-blot结果显示,与正常组比较,模型组PSD95蛋白表达明显减少(P<0.05);与模型组比较,多奈哌齐组和参枝苓组(大、中、小剂量)PSD95蛋白表达均增加,其中以多奈哌齐组和参枝苓中、小剂量组明显增加(P<0.05)。4参枝苓口服液对APP/PS1小鼠PI3K/Akt-mTOR通路相关蛋白mRNA的影响RT-PCR结果显示与正常组相比,模型组PI3KmRNA和AktmRNA表达减少,但无统计学差异(P>0.05);与模型组相比,多奈哌齐组和参枝苓组(大,中、小剂量)PI3KmRNA和AktmRNA表达均增加,但无统计学差异(P>0.05)。与正常组相比,模型组mTORmRNA表达明显减少(P<0.01);与模型组相比,多奈哌齐组和参枝苓组(大,中、小剂量)mTORmRNA表达均增加,差异具有显著性(P<0.01)。结论参枝苓口服液可以改善APP/PS1小鼠早期学习记忆障碍,在AD早期发挥髓鞘、突触保护作用,其潜在作用机制可能与增加海马CA1区突触数目,改善髓鞘板层结构和少突胶质细胞、神经元的超微结构,并通过调节PI3K/Akt-mTOR信号通路相关蛋白表达,改善通路功能有关。