[背景]随着经济的发展和生活方式的改变,肥胖的患病率迅速升高,已经成为威胁人类健康的最重要的世界性公共卫生问题之一。根据WHO统计的数据,1980年以来,全球肥胖症人数已增长了1倍。2008年全球20岁及以上的成年人中超重的人数达14亿,而这些超重的人当中又有2亿的男性和3亿的女性为肥胖。据估计,到2030年,全球超重人口将突破21.6亿,肥胖人口将达到11.2亿。肥胖是高血压、冠心病、糖尿病等疾病的危险因素,WHO的相关资料表明,肥胖已经成为当今世界第5大死亡原因。在全球范围内,肥胖在成人的患病率已经超过了10%,此外,44%的糖尿病、23%的缺血性心脏病、7%-41%不同肿瘤可归因于超重和肥胖。由此可见,肥胖已经成为当今最迫切需要解决的健康问题之一。肥胖是在长期能量摄取超过能量消耗的情况下导致白色脂肪在机体内沉积所致。与限制饮食相比,人们更倾向于提高能量代谢率来消耗过剩的脂肪。运动减肥是一种很好的方式,但是由于现代人生活节奏快工作压力大,许多人难以保证有足够的运动量来达到减肥的目的。在治疗肥胖方面,绝大多数减肥药由于各种各样的副作用而离开临床应用。因此我们迫切需要找到治疗肥胖的新的途径。棕色脂肪由于其独特的生理功能,近年来成为研究肥胖治疗重要靶点。哺乳动物体内的脂肪组织可以分为白色脂肪和棕色脂肪。白色脂肪是通过甘油三酯的形式储存机体过剩的能量,并可分泌多种脂肪因子调节能量代谢。而棕色脂肪可以通过氧化游离脂肪酸产热,从而维持人体在寒冷刺激时的体温平衡,或消耗机体过剩的能量达到机体的能量平衡。棕色脂肪细胞里含有很多线粒体,这些线粒体内膜表面含有大量组织特异性非常高的解偶联蛋白1(UCP1), UCP1能够通过运送质子消除线粒体跨膜电位,从而使线粒体氧化磷酸化的过程解偶联,进而驱动脂肪消耗并以热能的形式得到释放。这对于机体在寒冷刺激等情况下的适应性产热来说是非常重要的。不仅如此,棕色脂肪周围还布有丰富的毛细血管,交感神经纤维也能够直接到达棕色脂肪组织的细胞膜上。据估计,在完全激活的情况下,50g的BAT就可以消耗机体20%的基础代谢能量。过去认为成人体内不存在有功能的BAT,但是在2009年,5个独立的研究组使用利用了正电子发射断层扫描(Positron Emission Tomography, PET)和计算机断层扫描(Computed Tomography, CT)技术证实在成人颈部和锁骨上区域有代谢活跃区域,并取组织标本进行形态学检查和分子标志物分析,证明这些区域里有代谢活跃的棕色脂肪组织。Cypess等分析了1972位成年患者PET-CT扫描结果,发现5.4%的患者确实拥有棕色脂肪组织；他们还发现棕色脂肪组织的活性与年龄、体重指数、空腹血糖水平呈负相关,这也就是说,棕色脂肪组织与这些衡量身体健康良好与否的指标有关。成人体内丰富的具有活性的棕色脂肪的发现颠覆了对棕色脂肪的认识,也开辟了从临床医学角度利用棕色脂肪来治疗肥胖等代谢相关疾病的崭新领域。近年来,研究人员致力于将白色脂肪细胞和其他细胞转分化为棕色脂肪的研究。转录因子的诱导是实现棕色脂肪转分化的重要因素。研究发现,C/EBPβ能够体外诱导3T3L1前白色脂肪细胞转分化成为具有棕色脂肪细胞特征的细胞群。而成肌细胞则能够在PRDM16-C/EBPβ转录复合体的作用下转分化成为具有生理功能的棕色脂肪。此外PRDM16-C/EBPβ转录复合体还能够实现由成纤维细胞向棕色脂肪细胞的转分化。脂肪特异性过表达PRDM16的转基因小鼠出现皮下白色脂肪棕色化现象,而内脏白色脂肪没有出现这种现象。microRNA是非编码RNA (ncRNAs)中的一种,可以在转录后水平负性调控蛋白表达。哺乳动物体内的microRNAs调节超过60%的编码蛋白的基因,而一种microRNA可以调控数百种不同基因的mRNA。microRNA在脂肪细胞的转分化过程中也能起到非常重要的作用。脂肪特异性过表达miR-196a的转基因小鼠中,皮下白色脂肪和内脏白色脂肪都出现明显的棕色化。Sun等发现在C2C12肌原细胞系中过表达miR-193b/365,可以诱导分化棕色脂肪细胞；而在棕色脂肪前体细胞中敲除miR-193b/365,可以诱导分化为肌细胞。而2013年最新的研究结果表明,miR-133能够通过调控PRDM16实现由肌细胞向棕色脂肪细胞的转分化。最近的研究也揭示了miR-155是棕色脂肪重要的"microRNA开关”。miR-155转基因小鼠中UCP1表达受到抑制,miR-155敲除小鼠中UCP1表达则被激活。从能量平衡的角度看,通过增加产热从而提高能量的消耗来减轻体重,可以作为为一种抵抗肥胖的重要手段。在成年人体内发现具有活性的棕色脂肪后,研究人员就希望能够通过调节棕色脂肪的产热功能来治疗及预防肥胖和其相关的疾病。展望未来,有两种途径来增加棕色脂肪的总量和活性：一是通过小分子药物或者生长因子来刺激体内棕色脂肪的生长分化和激活；二是通过体外诱导干细胞分化成棕色脂肪细胞,然后植入肥胖患者体内,从某种意义上说就是脂肪组织移植。由于肥胖已经成为现代社会中严重危害健康的公共卫生问题。如前所述,肥胖与棕色脂肪有着相当紧密的联系。MicroRNA可以通过抑制翻译的过程或者使mRNA降解而广泛地参与到机体发育、细胞增殖和凋亡等过程中。近来,研究人员发现microRNA在白色脂肪向棕色脂肪转分化过程中也起着重要的作用。然而是否存在更多的microRNA能够促进白色脂肪棕色化仍需要进一步探讨。UCP1是棕色脂肪适应性产热的关键基因,但关于调控UCP1的microRNA的相关研究较少。因此,研究以UCP1为靶基因的相关microRNA可以更为深入地研究白色脂肪棕色化过程,从而为开发预防和治疗肥胖的药物打下良好的基础。研究分为以下2部分进行：第一章β3肾上腺素受体激动剂(CL316243)对C57BL/6J小鼠脂肪组织棕色化相关基因的影响[目的]研究β3肾上腺素受体激动剂(CL316243)处理的小鼠附睾脂肪、腹股沟脂肪、肩胛区棕色脂肪中的棕色化相关基因的mRNA表达量。[研究方法]1.14只6周龄C57BL/6J雄性小鼠随机分成2组,每组7只。实验组小鼠每天腹腔注射β3肾上腺素受体激动剂CL316,243(剂量为lmg/Kg),对照组小鼠腹腔注射生理盐水。每天注射1次,连续注射10天,取小鼠肩胛间区的棕色脂肪组织、腹股沟区的皮下脂肪组织和内脏的附睾脂肪,收集标本后立即放入-80℃保存。2.采用实时荧光定量PCR法检测附睾脂肪内UCP1、CIDEA、DI02、CPT1B.PGC-1α、 C/EBPβ、PRDM16、PPARγ2基因mRNA的表达量。3.采用实时荧光定量PCR法检测腹股沟脂肪内UCP1、CIDEA、PGC-1α、C/EBP β、PRDM16、PPARγ2基因mRNA的表达量。4.采用实时荧光定量PCR法检测肩胛区棕色脂肪内UCP1、CIDEA、PGC-1α、 C/EBP β、PRDM16、PPARγ2基因mRNA的表达量。5. HE染色法观察小鼠附睾脂肪细胞形态学变化。6.统计学处理：采用SPSS13.0统计软件进行处理,各指标数据采用均数±标准差(x±s)表示,两组间进行独立样本t检验。P<0.05被认为差异具有统计学意义。[结果]1.与对照组相比,CL316243组小鼠附睾脂肪和腹股沟脂肪中,脂肪合成相关基因PPAR γ2mRNA表达显著下调(P<0.05),而在棕色脂肪中PPARγ2mRNA表达也下调,但无统计学差异(P>0.05)。2.与对照组相比,CL316243组小鼠附睾脂肪中,棕色脂肪特异基因UCP1、CIDEA、D102和脂肪酸氧化相关基因CPTlBmRNA表达显著上调(P<0.05)；其他棕色脂肪分化相关PGC-1α、C/EBPβ、PRDM16基因的mRNA表达无统计学差异(P>0.05)。3.与对照组相比,CL316243组小鼠腹股沟脂肪中棕色脂肪特异基因UCP1、 CIDEA和棕色脂肪分化相关基因PGC-1α、C/EBPβ、PRDM16的mRNA表达均无统计学差异(P>0.05)。4.与对照组相比,CL316243组小鼠肩胛区棕色脂肪中棕色脂肪特异基因UCP1、 CIDEA和棕色脂肪分化相关基因PGC-1α、C/EBPβ、PRDM16的mRNA的表达均无统计学差异(P>0.05)。5.HE染色法观察两组小鼠附睾脂肪的形态学变化,对照组附睾脂肪呈现出大空泡的脂肪球,细胞核、细胞器及胞浆被挤到一侧呈薄环；在CL316243组附睾脂肪中,脂肪细胞较小,部分细胞核位于细胞中间,脂滴分散在多房室内。[结论]1. β3肾上腺素受体激动剂CL316243可以下调腹股沟和附睾脂肪脂肪合成能力；2. β3肾上腺素受体激动剂CL316243可以使附睾脂肪棕色化、脂肪酸氧化水平提高,从而提高小鼠的能量代谢水平。第二章β3肾上腺素受体激动剂(CL316243)对C57BL/6J小鼠脂肪组织棕色化相关microRNAs的影响[目的]初步探讨β3肾上腺素受体激动剂(CL316243)对以UCP1为靶基因的microRNA的影响。[研究方法]1.以UCP1为检索词,在miranda数据库进行靶向mi croRNA的预测,并筛选出最有可能以UCP1为靶基因的microRNA。2.采用实时荧光定量PCR法检测腹股沟脂肪内以UCP1为靶基因的miR-9、 miR-338-3p及非相关的miR-let7g的mRNA表达量。[结果]与对照组相比,CL316243组小鼠附睾脂肪中miR-9、miR-338-3p表达均显著下调(P<0.05),而miR-let7g表达量无明显差异(P>0.05)。[结论]β3肾上腺素受体激动剂(CL316243)可能通过下调miR-9和miR-338-3p mRNA而使UCP1基因表达增多,miR-9和miR-338-3p可能参与到白色脂肪棕色化的过程中。