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目的肺癌是一种常见的肺部恶性肿瘤,其死亡率居癌症死亡率之首。2008年,全基因组关联研究(GWAS)表明,位于15号染色体长臂的烟碱型乙酰胆碱受体(Nicotinic Acetylcholine Repeptors, nAChRs)基因簇CHRNA5/A3/B4的变异与吸烟相关性肺癌密切相关。其中,编码α5-烟碱型乙酰胆碱受体(α5-nAChR)的基因CHRNA5与肺癌的发生发展尤为相关。nAChRs是由α和β亚基组成的同源或异源五聚体,nAChRs广泛表达于中枢与周围神经系统。目前在正常组织中nAChRs的功能研究较多,而在肿瘤中功能研究很少。如果能够明确nAChRs亚基在肺癌细胞中的功能作用,那么,以nAChRs为基础的治疗有可能为肺癌的治疗提供新的研究思路和治疗靶点。本研究通过下调α5-nAChR的表达,采用实时荧光定量PCR、 Western blot、ELISA和MTT等实验方法,体外研究肺癌细胞中α5-nAChR对缺氧诱导因子(Hypoxia induced factor, HIF-1α)和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor)表达的影响,从而进一步探讨α5-nAChR/HIF-1a/VEGF信号轴对肺癌细胞增殖和凋亡的影响,为肺癌的预防治疗寻找新靶点提供依据。方法1.不同浓度尼古丁,作用于肺癌细胞株A549。荧光定量PCR检测尼古丁作用下,A549细胞中α5-nAChR、HIF-1α和VEGF mRNA的表达；Western bolt检测α5-nAChR和HIF-1α的蛋白表达；ELISA法检测VEGF蛋白的表达。2.设计合成编码α5-nAChR的CHRNA5基因siRNA片段,经脂质体介导转染A549细胞,实时荧光定量PCR检测siRNAα5-nAChR后,α5-nAChR.HIF-1α和VEGFmRNA的表达；Western blot检测α5-nAChR和HIF-1α的蛋白表达；ELISA法检测VEGF蛋白的表达。3.MTT法检测α5-nAChR-siRNA对尼古丁促A549细胞增殖作用的的影响。4.Western blot检测siRNA-α5-nAChR对凋亡相关因子bcl-2survivin的影响。结果1.实时荧光定量PCR结果显示,随着尼古丁浓度的增加,α5-nAChR和VEGF mRNA的表达逐渐上升,且1μmol/L尼古丁组α5-nAChR和VEGF mRNA的表达升高最明显,差异有统计学意义(P<0.05),而各组间HIF-1α mRNA的表达没有明显变化(P>0.05)。2.Western Blot结果显示,随着尼古丁浓度的增加,α5-nAChR和HIF-1α的蛋白表达随尼古丁浓度的增加而增高,1μmol/L尼古丁组α5-nAChR和HIF-1α的蛋白表达升高最明显,而5μmol/L尼古丁组α5-nAChR和HIF-1α的蛋白表达呈下降趋势,表明α5-nAChR和HIF-1α的蛋白表达呈现尼古丁浓度依赖性(P<0.05).3. ELISA结果显示,随着尼古丁浓度的增加,VEGF蛋白表达随着尼古丁浓度的增加而增高,1μ mol/L尼古丁组VEGF蛋白表达升高最明显,而5μmol/L尼古丁组VEGF的蛋白表达明显下降,表明VEGF的蛋白表达呈现尼古丁浓度的依赖性(P<0.05)。4. CHRNA5-siRNA转染A549细胞48h后,荧光定量PCR结果显示,0μmol/L尼古丁组α5-nAChR.HIF-1α口VEGF mRNA的相对水平为1,与si-NC转染组相比,siRNA转染组α5-nAChR、HIF-1α和VEGF mRNA的表达均下降(P<0.05)。与1μ mol/L尼古丁组和(1μ molLNicotine+si-NC)转染组相比,(1μ mol/L Nicotine+siRNA)转染组,α5-nAChR.HIF-1a和VEGF mRNA的相对表达均下降(P<0.05)。5. CHRNA5-siRNA转染A549细胞48h后,Western Blot结果显示,与尼古丁0μ mol/L和siNC转染组相比,siRNA组α5-nAChR和HIF-1α的蛋白表达下降(P<0.05)。与1μmol/L尼古丁组和(1μmol/LNicotine+si-NC)转染组相比,(1μmol/L Nicotine+siRNA)转染组,α5-nAChR和HIF-1α的蛋白表达下降(P<0.05)。6. CHRNA5-siRNA转染A549细胞48h后,ELISA结果显示,与尼古丁0μmol/L和si-NC转染组相比,si-RNA组VEGF的蛋白表达下降(P<0.05)。与1μmol/L尼古丁组和(1μmolμLNicotine+si-NC)转染组相比,(1μmol/L Nicotine+siRNA)转染组,VEGF的蛋白表达下降(P<0.05)。7. CHRNA5-siRNA转染A549细胞48h后,无尼古丁处理组中,发现CHRNA5-siRNA转染组细胞增殖与阴性对照组相比,细胞增殖抑制率较对照组细胞高(P>0.05),尼古丁处理组,与对照组相比,转染组A549细胞的增殖明显受抑制(P<0.01)。8. CHRNA5-siRNA转染A549细胞48h后,Western Blot结果显示,与0μ mol/L尼古丁组和si-NC转染组相比,si-RNA组bcl-2和survivin蛋白的表达明显下降(P<0.05)。与1μmol/L尼古丁组和(1μmol/LNicotine+si-NC)转染组相比,(1μmol/L Nicotine+siRNA)转染组,bcl-2和survivin蛋白的表达明显下降(P<0.05)。结论1.尼古丁促进A549细胞中α5-nAChR和VEGF mRNA和蛋白的表达,促HIF-1α蛋白的表达,并且三者的表达都呈现尼古丁浓度的依赖性。2.siRNA-α5-nAChR后,能够抑制尼古丁促肺癌细胞的增殖作用。同时,HIF-1α和VEGF mRNA和蛋白的表达下降,提示a5-nAChR可能通过HIF-1α和VEGF影响肺癌细胞增殖,表明可能存在α5-nAChR/HIF-1α/VEGF信号轴,并在非小细胞肺癌的增殖过程中发挥重要作用。3. siRNA-α5-nAChR后,HIF-1α、VEGF、bcl-2和suvivin蛋白的表达下降,提示,α5-nAChR可能通过HIF-1α和VEGF调节bcl-2和survivin表达进而影响细胞凋亡,综上表明,α5-nAChR/HIF-1α/VEGF信号轴可能是导致吸烟相关性肺癌发生的重要分子机制之一