胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类的健康与生命，在其综合治疗中，化疗仍然占重要地位，许多因素可以影响化疗的效果，其中肿瘤的多药耐药（multidrug resistance，MDR）是化疗失败的主要原因之一。研究产生MDR现象的机制及克服的方法已成为肿瘤研究的重要课题。MDR是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药性的同时，对其它结构不同、作用靶位各异的抗肿瘤药物也产生耐药性。以往已知MDR的相关机制很多，如P-糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白（MRP）、热休克蛋白、肺耐药蛋白（LRP）的高表达，谷胱甘肽S-转移酶和谷胱甘肽升高，拓扑异构酶活力降低，凋亡抑制以及肿瘤细胞某些生化特征的改变等。新近又发现葡萄糖神经酰胺合成酶（glucosylceramide synthase，GCS）高表达与肿瘤MDR密切相关。GCS是一种葡萄糖转移酶，参与神经酰胺的代谢，可催化UDP-glucose上的糖基转运到神经酰胺生成葡萄糖神经酰胺（glucosylceramide，GlcCer），使细胞逃避神经酰胺介导的凋亡作用而产生MDR。神经酰胺是鞘脂类代谢的主要分子，在诱导细胞凋亡中起着重要作用，是介导细胞凋亡的第二信使，它在多种信号转导过程中发挥广泛的作用，其糖基化代谢产物GlcCer是细胞合成其他鞘糖脂的前体物质，它与肿瘤细胞的生物学行为密切相关，不仅维持着细胞的正常结构功能，还参与了细胞增殖、分化及肿瘤细胞的多药耐药。GCS为神经酰胺糖基化的限速酶，具有底物特异性，对MDR的产生有重要作用。抑制GCS延缓神经酰胺糖基化，增加细胞内神经酰胺的含量已成为逆转MDR的有效策略。近期也发现了一些能抑制GCS的药物，但这些药物在临床应用中特异性不高，毒副作用严重，难以达到逆转MDR的有效血浆浓度，并且肿瘤细胞也可以对这些药物产生耐药，其临床应用受到限制。虽然反义核酸技术也可逆转肿瘤MDR，但存在特异性不强、效率不高等缺点。因而迫切需要寻找有效的逆转肿瘤MDR的治疗策略。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种由双链RNA介导的转录后基因沉默技术。由于RNAi抑制的高效性和特异性，被广泛应用于基因组功能和疾病治疗的研究中。在胃癌临床治疗中MDR是困扰化疗成功的一个主要因素，虽然众多的研究者在逆转MDR方面作了大量工作，但迄今没有一种有效药物能很好的用于临床治疗。以往对胃癌MDR机理的研究多集中在多药耐药基因及P-gp等方面，对于GCS与胃癌耐药关系的研究到目前为止国内外均未见报道。为探讨GCS在胃癌多药耐药中的作用以及靶向GCS小干扰RNA（small interferingRNA，siRNA）对胃癌耐药的影响，本课题首先采用RT-PCR、免疫组化和免疫印迹技术联合检测了几种胃癌细胞系中GCS基因的表达，揭示GCS与胃癌的发生发展与多药耐药的关系。在此基础上，以GCS基因为靶点，采用RNA干扰技术构建3个GCS siRNA真核表达载体R1-pSUPER EGFP、R2-pSUPER EGFP、R3-pSUPER EGFP，并将其瞬时转染入人胃癌耐药细胞SGC7901／VCR，比较其对GCS的干扰效果，筛选出抑制作用强的重组质粒R1-pSUPER EGFP，进而用重组质粒R1-pSUPER EGFP稳定转染SGC7901／VCR细胞，检测耐药相关基因GCS和mdr1的表达水平、凋亡相关因子bcl-2、bax、caspase-3表达的改变及细胞凋亡率，并观察转染细胞生长情况和对化疗药物的敏感性，最后将稳定转染的细胞导入裸鼠体内，观察GCS siRNA对裸鼠移植瘤生长的抑制作用及对移植瘤组织细胞凋亡和耐药相关基因GCS表达的影响。通过体外和体内试验，从基因、蛋白和肿瘤细胞生物学行为等多个方面研究GCS与胃癌多药耐药的关系及GCS引起MDR产生的分子机理，并深入探讨下调GCS的表达对逆转胃癌多药耐药的作用，为今后应用靶向GCS siRNA载体作为临床增加胃癌患者化疗敏感性的手段和RNA干扰技术在胃癌临床基因治疗上的应用提供了可靠的理论依据。方法1．常规培养GES-1、BGC823、SGC7901和SGC7901／VCR细胞。其中SGC7901／VCR细胞培养液中加入长春新碱（vincristine，VCR）0.5～1.0μg／ml，以维持其相应的耐药表型。于检测前撤除VCR培养2周。2．应用RT-PCR、免疫组化和Western blot的方法在mRNA水平和蛋白水平上检测GCS在GES-1、BGC823、SGC7901和SGC7901／VCR细胞中的表达。3．采用四甲基偶氮唑盐（MTT）光吸收法，检测胃癌细胞SGC7901和SGC7901／VCR对化疗药物阿霉素（ADR）、VCR、5-氟脲嘧啶（5-FU）和顺铂（DDP）的敏感性。4．设计合成3对针对葡萄糖神经酰胺合成酶（GCS）基因编码的反向重复序列，并将其定向克隆入真核表达载体pSUPER EGFP中，构建GCS siRNA真核表达载体R1-pSUPER EGFP、R2-pSUPER EGFP、R3-pSUPER EGFP。5．将3种GCS siRNA表达载体分别体外瞬时转染人胃癌耐药细胞SGC7901／VCR，应用RT-PCR和Western blot方法检测3种重组质粒对转染后细胞中GCS mRNA和蛋白表达的影响，并比较其干扰效果，筛选作用强的重组质粒进行后续试验。6．用干扰效果好的重组质粒R1-pSUPER EGFP转染胃癌SGC7901／VCR细胞，并筛选扩增阳性细胞，建立稳定转染细胞系。7．应用MTT光吸收法和生长曲线检测和反映重组质粒R1-pSUPER EGFP转染后对SGC7901／VCR细胞生长的影响。8．采用RT-PCR和Western blot方法检测稳定转染重组质粒后对胃癌细胞SGC7901／VCR中GCS、mdr1mRNA和P-gp表达的影响。9．采用RT-PCR和免疫组化方法检测转染重组质粒后SGC7901／VCR细胞中凋亡相关因子bcl-2、bax、caspase-3的表达水平；应用流式细胞技术检测转染重组质粒后SGC7901／VCR细胞凋亡情况。10．应用MTT法检测转染重组质粒后SGC7901／VCR细胞对化疗药物ADR、VCR、5-FU和DDP的敏感性。11．将稳定转染GCS重组质粒、转染空载体和未转染空白对照细胞SGC7901／VCR分别注入裸鼠背部皮下，建立裸鼠胃癌移植瘤模型。定期观察成瘤情况，每6天测量肿瘤大小一次，绘制肿瘤生长曲线。测量肿瘤体积和重量，计算肿瘤抑制率，观察不同组裸鼠移植瘤的生长情况。12．应用HE染色的方法，观察瘤体组织结构；RT-PCR和免疫组化方法检测移植瘤组织中GCS的表达水平；TUNEL法检测移植瘤组织细胞凋亡情况。13．应用SPSS10.0统计软件进行统计学分析。计量资料数据用均数±标准差（（?）±s）表示，两组均数的比较用t检验，多样本均数的比较用方差分析。计数资料计算阳性率，阳性率之间的比较采用x²检验。以α=0.05为检验水准。结果1．RT-PCR、免疫组化和Western blot结果表明GCS在GES-1、BGC823、SGC7901和SGC7901／VCR细胞中均有表达。RT-PCR结果显示，GCS mRNA的相对表达量GES-1为0.23±0.01，BGC823为0.36±0.02，SGC7901为0.49±0.04，SGC7901／VCR为0.98±0.01，GES-1细胞GCS mRNA表达水平最低，耐药细胞SGC7901／VCR表达水平最高，显著高于亲本细胞SGC7901（P＜0.05）；免疫组化标本上，GCS蛋白阳性表达呈棕黄色颗粒，位于胞浆内，蛋白表达阳性率以耐药细胞SGC7901／VCR最高，明显高于其它细胞（P＜0.05）；Westernblot分析结果显示，各组细胞在蛋白上样量相同的条件下，GES-1细胞GCS蛋白条带显色最弱，BGC823其次，SGC7901增强，SGC7901／VCR最重。2．体外药物敏感性分析结果显示SGC7901／VCR细胞对ADR、VCR、5-FU和DDP的IC₅₀均高于SGC7901细胞（P＜0.05）。3．酶切鉴定R1-pSUPER EGFP、R2-pSUPER EGFP、R3-pSUPER EGFP重组质粒，结果显示双酶切后可正确释放出约285bp片段，与质粒图谱资料相符。DNA测序证实，重组质粒中插入片段的碱基组成与设计的DNA序列完全一致，表明成功构建了针对GCS基因的siRNA表达载体。4．重组质粒瞬时转染SGC7901／VCR细胞后，RT-PCR及Western blot结果显示转染3种重组质粒后SGC7901／VCR细胞中GCS表达水平的变化程度不同，其中以转染R1-pSUPER EGFP的细胞中GCS的表达水平降低最为明显，转染另外两种重组质粒的细胞中GCS的表达水平下降不明显，说明针对GCS的siRNA载体可以在真核细胞中表达，并以R1-pSUPER EGFP所表达的小干扰RNA对GCS的抑制效果最好。5．重组质粒稳定转染SGC7901／VCR细胞后，生长曲线显示转染重组质粒细胞与转染空载体和空白对照组相比，细胞生长曲线上升缓慢，细胞生长速度减慢。6．RT-PCR结果显示转染重组质粒细胞的GCS mRNA和mdr1 mRNA的相对含量明显低于转染空载体和空白对照组（P＜0.05）。Western blot检测也显示R1-pSUPER EGFP重组质粒转染能明显抑制SGC7901／VCR细胞中GCS蛋白和P-gp的表达，其抑制率分别为83.5％和74％。7．稳定转染后对凋亡相关因子检测结果显示，转染重组质粒细胞中促凋亡因子bax、caspase-3表达水平升高，抑凋亡因子bcl-2表达水平降低，与空载体组和空白对照组细胞相比，差异显著（P＜0.05）。8．流式细胞术检测结果显示转染重组质粒组细胞凋亡率（33.35±0.11％）显著高于转染空载体组（5.09±0.02％）和空白对照组（3.98±0.04％），差异有统计学意义（P＜0.05）。9．MTT检测细胞对化疗药物的敏感性结果显示，与未转染空白对照细胞和转染空载体细胞相比，转染重组质粒细胞对ADR、VCR、5-FU和DDP的IC₅₀减小，耐药指数降低，敏感性增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。10．接种重组质粒组细胞裸鼠体内成瘤时间延迟，肿瘤体积及重量明显小于空白对照组和空载体组（P＜0.05），重组质粒组裸鼠肿瘤体积抑制率和重量抑制率分别为64.13％和63.81％。组织病理学检测显示，重组质粒组肿瘤组织坏死较多。RT-PCR和免疫组化结果显示，重组质粒组裸鼠肿瘤组织中GCS mRNA和蛋白表达水平明显降低，与空白对照组和空载体组相比，差异显著（P＜0.05）。TUNEL检测结果显示，重组质粒组裸鼠肿瘤组织细胞凋亡阳性率显著高于空白对照组和空载体组（P＜0.05）。结论1．胃癌细胞中均存在GCS基因的表达，但不同的细胞GCS表达强弱程度不同。耐药细胞株中GCS mRNA和蛋白的表达水平最高，明显高于亲本敏感细胞，提示GCS参与了胃癌的发生发展过程，并与胃癌细胞的多药耐药有关。2．成功构建了3个GCS siRNA真核表达载体，其在胃癌耐药细胞中对GCS的干扰效果不同，提示重组质粒对靶基因的抑制效果与靶序列的结构和位置有关。通过试验优选出干扰效果最佳者R1-pSUPER EGFP，保证其基因沉默的特异性和高效性，为进一步探索靶向封闭GCS对胃癌细胞多药耐药的影响奠定基础。3．建立了稳定转染GCS siRNA表达载体的胃癌细胞系。GCS siRNA载体抑制GCS表达，同时可下调mdr1的表达，上调凋亡相关因子caspase-3和bax的表达，诱导耐药细胞凋亡增加，使细胞对化疗药物的敏感性增高。4．裸鼠体内GCS siRNA表达载体可特异性抑制胃癌耐药细胞移植瘤组织中GCS的表达，诱发移植瘤细胞凋亡，抑制移植瘤的生长。提示GCS siRNA表达载体可能会成为逆转胃癌细胞多药耐药和胃癌基因治疗的一种新手段，同时也为临床胃癌基因治疗提供理论依据。