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研究背景:肾间质纤维化是慢性肾脏病（CKD）的主要病理改变,其一旦发生将持续进展,最终导致终末期肾病（ESRD）的发生。但截至目前,肾间质纤维化的发生、发展机制仍未完全阐明,抗肾纤维化的治疗策略始终未能达到良好预期。因此,深入探讨肾间质纤维化的发生机理并寻找有效的干预措施具有极其重要的临床意义。炎症是肾纤维化发生和发展的一个重要始动因素。干扰素调节因子-1（Interferon regulator factor 1,IRF-1）是IRFs家族的主要成员,在多种成体细胞中均有表达,作为转录因子调控一系列靶基因转录,参与炎症损伤、免疫反应、肿瘤免疫监视及病毒感染等多种生理和病理过程。众所周知,免疫异常和炎症是许多肾脏疾病的关键致病机制。近年来,有研究发现ROS通过诱导IRF-1在受损的肾小管上皮细胞表达,进而导致促炎基因上调,以此加重缺血性急性肾损伤。在新生大鼠UUO模型中,IRF-1在梗阻侧肾脏的表达显著增加。值得关注的是,近期研究发现IRF-1和Klotho以反向作用参与了肾脏钙磷代谢的生理过程。在Janus激酶3（JAK3）敲除小鼠的肾脏中,Cyp27b1的转录水平显著升高,导致1,25（OH）2D3的产生增多,并发现这与JAK3敲除后肾脏IRF-1表达增加和Klotho表达下调有关。研究证实,肾脏IRF-1表达增加促进了Cyp27b1的表达和1,25（OH）2D3的产生,而Klotho则下调了Cyp27b1的表达,降低了1,25（OH）2D3合成。IRF-1的上调以及Klotho的减少提示IRF-1和Klotho之间可能存在负调控关系。Klotho主要在肾小管上皮细胞中高度表达,包括膜型和分泌型两种类型的编码蛋白,而膜Klotho蛋白的胞外段剪切后及分泌型Klotho蛋白可以进入血循环,被称为可溶性Klotho蛋白,可对多个器官和细胞发挥保护作用。近年来,Klotho被证实为重要的抑制肾纤维化的因子,可以显著抑制TGF-β、Wnt/β-catenin信号通路和RAS系统活化,从而改善单侧输尿管梗阻（UUO）或阿霉素肾病（ADR）模型的肾间质纤维化。我们既往也证实Klotho可以通过与FGF2竞争结合FGFR受体抑制FGF2信号通路活化,减轻肾小管上皮细胞转分化和成纤维细胞增殖与活化,进而改善肾间质纤维化。同时,研究发现,在CKD及肾间质纤维化发生时Klotho在肾脏的表达水平显著降低。因此,Klotho表达下降是肾间质纤维化发生、发展的重要环节。但迄今为止,人们并未阐明CKD时Klotho表达为什么会显著降低,而明确CKD时导致Klotho表达下调的关键分子机制可能是探寻肾间质纤维化有效干预措施的重要突破口。据此,我们推测,在CKD时IRF-1可能通过抑制Klotho表达,诱导肾小管上皮细胞分泌致纤维化因子,最终导致肾间质纤维化的发生和发展。为验证以上推论,本课题首先观察了CKD患者、单侧输尿管梗阻（Unilateral Ureteral Obstruction,UUO）和阿霉素肾病（Adriamycin nephropathy,ADR）模型小鼠肾小管上皮细胞IRF-1的表达变化,以及其与肾纤维化程度之间的相关性;随后利用体外研究,在体外培养人肾小管上皮细胞（HK-2）、人胚胎肾细胞293（HEK293）中研究IRF-1对肾小管上皮细胞纤维化标志物表达的影响,探讨其作用是否与调控Klotho表达有关,并阐明上、下游分子机制;最后利用IRF-1基因敲除(IRF-1-/-)小鼠和C57BL/6J小鼠分别制备UUO模型,C57BL/6J小鼠制备的UUO模型给予尾静脉注射抗TNF-α中和抗体,明确敲除或抑制IRF-1通过调控Klotho改善肾间质纤维化的作用。方法和结果:第一部分:IRF-1与肾间质纤维化的相关性研究1.CKD患者肾活检标本中IRF-1表达增加,与肾间质纤维化程度呈显著正相关:我校第二附属医院肾内科生物标本库选取肾活检标本中无明显肾脏病理改变的肾活检标本和有肾纤维化病变的CKD患者标本,分别进行Masson染色和IRF-1免疫组织化学染色,分析肾间质纤维化程度和IRF-1表达水平。结果显示,与正常肾组织相比,在CKD患者纤维化肾组织中,IRF-1在肾小管上皮细胞的表达显著增加,IRF-1的表达水平与肾间质纤维化面积呈显著正相关,而与eGFR值呈显著负相关。这些结果表明CKD患者肾组织中IRF-1的表达可能与肾间质纤维化的严重程度密切相关。2.UUO模型和阿霉素肾病（ADR）模型小鼠肾小管上皮细胞IRF-1的表达增加:野生型雄性C57BL/6小鼠32只,10-12周龄,分别制备UUO模型和ADR模型,造模后14天处死各实验组小鼠,肾脏取材。通过HE（Hematoxylin-eosin）、Masson、免疫组化染色和蛋白质免疫印迹法（Western blot,WB）检测肾脏损伤、肾纤维化程度和IRF-1表达情况。结果发现,UUO和ADR模型小鼠肾脏出现显著损伤和纤维化,并且肾近曲小管上皮细胞IRF-1表达显著增加。因此,在两种肾纤维动物模型中我们再次发现IRF-1可能与肾间质纤维化密切相关。3.IRF-1过表达显著促进肾小管上皮细胞纤维化标志物的表达:构建人IRF-1质粒并转染体外培养人肾小管上皮细胞（HK-2）和大鼠肾小管上皮细胞（NRK52E）,利用Western blot检测IRF-1、α-SMA和fibronectin的表达变化。结果发现,正常情况下,HK-2细胞和NRK52E细胞中IRF-1仅有微弱的表达;而IRF-1质粒转染导致细胞过表达IRF-1后,可以显著诱导纤维化标志物α-SMA和fibronectin的表达上调。以上结果表明,IRF-1过表达能够显著促进肾小管上皮细胞纤维化标志物的表达。第二部分:IRF-1通过调控Klotho促进肾小管上皮细胞纤维化标志物表达的作用和机制研究1.CKD患者和UUO小鼠模型肾组织中Klotho表达降低,与IRF-1表达呈负相关:第一部分生物标本库中已选取的无明显肾脏病理改变的肾活检标本和有肾纤维化病变的CKD患者肾活检标本进行免疫组织化学染色,检测Klotho表达水平。结果显示,与正常肾组织相比,在CKD患者的纤维化肾组织中,肾小管上皮细胞Klotho表达显著减少,并与IRF-1表达呈显著负相关,这说明CKD患者肾组织中IRF-1表达升高可能与Klotho表达降低有着密切关联。野生型雄性C57BL/6小鼠32只,10-12周龄,UUO建模。建模后3天、7天和14天肾脏取材。利用Western blot、Real-time PCR和免疫荧光双染,检测IRF-1和Klotho在小鼠肾组织中的表达,及IRF-1和Klotho在肾小管上皮细胞的共定位情况。结果表明,在UUO模型组,梗阻侧肾小管上皮细胞IRF-1的表达增加伴随着Klotho的表达下调。以上结果表明,肾间质纤维化时IRF-1的高表达伴随着Klotho表达的显著降低,两者之间的是否存在调控关系值得深入探讨。2.IRF-1通过下调Klotho促进HK-2细胞纤维化标志物表达:IRF-1质粒转染至HK-2细胞,Western blot检测Klotho的表达变化,结果发现IRF-1过表达以剂量依赖性的方式抑制Klotho的表达。如果同时转染IRF-1和Klotho质粒,利用Western blot检测纤维化标志物α-SMA和fibronectin的表达变化,则发现Klotho过表达明显逆转了IRF-1质粒转染诱导的α-SMA和fibronectin表达,提示IRF-1通过抑制Klotho促进了肾小管上皮细胞纤维化标志物的表达。3.IRF-1抑制Klotho基因转录体外培养人胚肾细胞（HEK293）,Western blot检测IRF-1的表达情况,结果表明,正常情况下,HEK293细胞中IRF-1仅有微弱的表达;而同时转染IRF-1质粒和Klotho启动子荧光素酶报告质粒（Klotho promoter reporter）,利用双萤光素酶报告基因试剂盒检测Klotho启动子荧光素酶活性的变化,发现IRF-1过表达以剂量依赖性的方式抑制Klotho（KL）启动子驱动的荧光素酶活性。利用JASPAR数据库预测出转录因子IRF-1在人Klotho启动子（包括Klotho转录起始位点上游4000bp）上存在13个潜在结合位点,分别设计引物,染色质免疫共沉淀法（ChIP）明确IRF-1是否直接结合到Klotho启动子区。结果发现,PCR产物均无明显阳性条带表达。提示IRF-1可以抑制Klotho基因转录,但并非直接与Klotho启动子区结合来调控其转录。4.IRF-1通过干扰C/EBP-β的活化下调HK-2细胞Klotho的表达为了探讨IRF-1抑制Klotho转录的机制,我们利用三个生物信息学数据库（PROMO、Genecards和JASPAR）分析人Klotho基因启动子,预测出可能与Klotho启动子区域结合（相对分数在80分以上）的11个转录因子,其中9个转录因子被报道参与了肾纤维化。为了明确介导IRF-1调控Klotho的转录因子,IRF-1质粒转染HK-2细胞后,Real-time PCR检测9个转录因子,即C/EBP-β、PPAR-γ、p53、SP1、YY1、USF2、C/EBP-α、GATA3和ATF3mRNA的表达变化。结果发现,IRF-1过表达显著抑制HK-2细胞中C/EBP-βmRNA表达水平（降低到三分之一）。Western blot检测发现IRF-1过表达以剂量依赖性的方式抑制C/EBP-β的蛋白表达。如果同时转染IRF-1和C/EBP-β质粒,利用Western blot检测Klotho、纤维化标志物α-SMA和fibronectin的表达变化,则发现C/EBP-β过表达明显逆转了IRF-1质粒转染诱导的Klotho表达下调及α-SMA和fibronectin的表达增高。此结果提示,IRF-1通过干扰C/EBP-β活化下调了Klotho的表达,进而促进肾小管上皮细胞纤维化标志物的表达。5.C/EBP-β通过直接结合到Klotho启动子区域调控其转录构建一系列Klotho启动子荧光素酶报告质粒截短体KL5（-2000bp～+100bp）、KL4（-1705bp～+100bp）、KL3（-1530bp～+100bp）、KL2（-1220bp～+100bp）和KL1（-1000bp～+100bp）,分别与C/EBP-β质粒共转染到HEK293细胞。利用双荧光素酶报告基因试剂盒检测Klotho启动子截短体荧光素酶活性的变化。结果发现,C/EBP-β过表达显著增强KL5、KL4、KL3和KL2驱动的荧光素酶活性,而对KL1和PGL3-Basic驱动的荧光素酶活性无影响。对Klotho启动子（KL2）中的第二个C/EBP-β结合位点进行了位点特异性突变,利用双荧光素酶报告基因试剂盒检测发现,C/EBP-β过表达对突变的KL2截短体驱动的荧光素酶活性没有影响。C/EBP-β质粒转染至HK-2细胞,染色质免疫沉淀（Ch IP）检测证实C/EBP-β可以直接结合到Klotho启动子中第2个C/EBP-β潜在结合位点的优势区域。以上结果表明,C/EBP-β能够直接结合到Klotho启动子区（-1039～-1029）调控其转录。6.TNF-α诱导HK-2细胞IRF-1表达升高TNF-α孵育HK-2细胞,Western blot检测IRF-1、C/EBP-β、Klotho、α-SMA和fibronectin的表达变化,结果发现TNF-α以剂量依赖性的方式诱导IRF-1、α-SMA和fibronectin的表达,同时伴随着C/EBP-β和Klotho的表达下调。IRF-1 siRNA转染至HK-2细胞后再加入TNF-α处理,Western blot检测Klotho、α-SMA和fibronectin的表达变化,结果发现,siRNA干扰IRF-1明显逆转了TNF-α对Klotho、α-SMA和fibronectin表达的影响,提示TNF-α通过诱导IRF-1下调Klotho,促进肾小管上皮细胞纤维化标志物表达。同样,C/EBP-β质粒转染HK-2细胞后用TNF-α处理细胞,Western blot检测Klotho、α-SMA和fibronectin的表达变化,发现C/EBP-β过表达也显著逆转了TNF-α诱导的Klotho表达减少,以及α-SMA和fibronectin的表达增加。这些结果提示,TNF-α可以诱导IRF-1表达升高,随之通过抑制C/EBP-β的活化来下调Klotho的表达,并可能因此促进了肾纤维化。第三部分:敲除或抑制IRF-1显著改善肾间质纤维化1.IRF-1基因敲除(IRF-1-/-)小鼠制备的UUO模型肾纤维化明显减轻IRF-1-/-小鼠和野生型（WT）小鼠各16只,10～12周龄,分别随机选取8只制备UUO模型,造模14天后处死各组小鼠,肾脏取材。利用HE、Masson染色评估肾脏损伤和肾纤维化程度,结果发现,IRF-1-/-小鼠梗阻侧肾脏损伤和肾纤维化程度较WT小鼠明显减轻;通过Western blot和免疫染色检测小鼠肾组织中α-SMA和fibronectin的表达变化,发现与WT小鼠相比,IRF-1-/-小鼠梗阻侧肾组织中α-SMA和fibronectin的表达明显减少。这说明敲除IRF-1可以明显减轻UUO模型小鼠肾纤维化。利用Real-time PCR检测炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达变化,发现与WT小鼠相比,IRF-1-/-小鼠梗阻侧肾组织中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达明显减少,提示敲除IRF-1可以明显减轻UUO模型小鼠肾组织的炎症反应。为进一步验证IRF-1的作用机制,Real-time PCR、Western blot和免疫染色检测C/EBP-β和Klotho的表达变化,结果表明,与WT小鼠相比,IRF-1基因敲除可以部分逆转UUO模型小鼠梗阻侧肾组织和肾小管上皮细胞C/EBP-β及Klotho的表达下调。以上结果提示,敲除IRF-1可以明显减轻C/EBP-β和Klotho的表达下调,改善肾间质纤维化;而UUO造成的IRF-1表达升高,及随之而来的C/EBP-β和Klotho表达下调可能是肾间质纤维化发生和发展的重要机制之一。2.UUO模型小鼠尾静脉注射抗TNF-α中和抗体显著抑制Klotho表达下调和肾间质纤维化雄性C57BL/6小鼠32只,10-12周龄,随机选取16只小鼠建立UUO模型,在假手术组和UUO模型组中分别选取8只小鼠尾静脉注射抗TNF-α中和抗体,其余8只小鼠注射等体积的PBS溶液。术后14天处死各组小鼠并肾脏取材。HE、Masson染色评估肾脏损伤和肾纤维化程度,结果发现给予抗TNF-α中和抗体注射的小鼠梗阻侧肾脏损伤和纤维化程度较PBS注射小鼠明显减轻。利用Western blot和免疫荧光双标染色检测肾组织中IRF-1、Klotho、α-SMA和fibronectin的表达,以及IRF-1和Klotho在肾小管上皮细胞的表达情况,结果发现,与注射PBS溶液的小鼠相比,注射抗TNF-α中和抗体显著抑制了UUO模型小鼠梗阻侧肾组织及肾小管上皮细胞中IRF-1的表达升高和Klotho的表达降低。以上结果提示,抗TNF-α中和抗体可通过抑制IRF-1改善肾间质纤维化。结论:CKD患者肾活检标本,UUO模型和ADR模型小鼠肾组织和肾小管上皮细胞中IRF-1表达显著增加,并与肾纤维化程度呈显著正相关;IRF-1过表达显著降低了肾纤维化抑制因子Klotho的表达,并促进肾小管上皮细胞纤维化标志物的表达,其作用与下调Klotho转录的调控因子C/EBP-β的表达有关;进一步研究表明,TNF-α是诱导UUO时肾小管上皮细胞IRF-1高表达的主要原因;而敲除或利用抗TNF-α中和抗体抑制IRF-1则可以显著改善肾间质纤维化。因此,炎症因子诱导的IRF-1表达上调,以及随之导致的肾小管上皮细胞Klotho缺乏可能是肾纤维化发生和发展的重要机制之一,而炎症与IRF-1/Klotho之间的相互影响也会不断促进肾纤维化的持续进展。