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干旱是严重影响作物生长和产量的主要环境限制因素之一。在干旱胁迫下,植物表达的基因分为两类:1.基因编码的产物为一些功能蛋白和酶类,如LEA,水通道蛋白,脯氨酸合成酶等;2.基因编码的产物为传递信号和调控基因表达的转录因子,如bZIP,MYC,DREB等。对于第二类基因,鉴于这些基因的表达调控其下游一系列功能基因,目前已成为抗旱基因工程的重点。DREB(Dehydration Responsive Element Binding)和CBF1(CRT/DRE binding factor 1)是拟南芥菜中发现的一个顺式调控元件,在逆境胁迫下,DREB和CBF1转录因子可激活其它多达12个依赖DRE顺式作用元件的抗逆功能基因,如RD29、COR15、RD17,从而使植株多方面的抗逆性(抗旱、抗冻及抗盐)得到提高,因此克隆DREB1B和CBF1基因,并转化到小麦品种中,以提高小麦的对干旱胁迫的抗性。 本实验以冬小麦8901,5-98,99—92和保丰104品种为受体品种,以基因枪微弹轰击转化携带有目的基因DREB1B和CBF1基因的逆境诱导表达类型质粒pBPC128F和pBPC127F载体获得的转基因再生植株79株为材料,经除草剂Basta(100mg/L)抗性鉴定T1代,部分转基因株系表现出明显的抗性。 转外源转录因子DREB1B基因株系采用点杂交与PCR结合的方法对转基因小麦T0和T1代快速进行DNA水平的分子鉴定,同时作了RNA的分子检测,结果表明所选转基因植株中外源基因能够正常转录。 对经过检测的转DREB1B基因株系采用与抗旱性密切相关的相对含水量,叶绿素含量,脯氨酸含量,光合速率四个生理指标进行测定,有10个株系在四个生理指标上相比对照都有明显提高,其中相对含水量均在15%以上,明显高于CK(7.19~9.13%);叶绿素含量中,叶绿素a含量均在0.07μg/ml以上,叶绿素b含量在0.14μg/ml以上,高于CK的叶绿素a(0.02~0.05μg/ml)和叶绿素b(0.5~0.9μg/ml);脯氨酸含量在1000μg/g以上,是对照(222.1~604.44μg/g)的2倍多;光合速率均在8.0μmol CO2/m2/s以上,高于CK(2.27~2.47μmol CO2/m2/s)。 室内抗旱模拟试验表明,转基因株系停止浇水15天后,叶片仍然表现绿色,而对照叶片则失绿、枯干;复水10天后,转基因株系恢复活力,对照则死亡。 转外源转录因子CBF1基因株系选用地高辛标记的CBF1和bar基因作为探针,进行点杂交检测。结果表明,无论是用CBF1探针,还是bar基因探针,证明了外源基因已整和