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辽东楤木(Aralia elata (Miq.) Seem),系五加科楤木属落叶小乔木。传统中草药,入药部位是根皮、茎皮、叶及嫩芽,具有补气安神、强精滋肾、祛风活血、除湿止痛等功效,用于治疗神经衰弱、风湿性关节炎和恶性肿瘤等症。最新研究表明：辽东楤木茎、叶具有较强的抗肝损伤作用,而且已经研制、开发出治疗肝炎的新药。辽东楤木主要入药成分是齐墩果烷型三萜皂苷,而且含量较高。齐墩果烷型三萜皂苷的生物合成途径已经明确,法呢基焦磷酸合成酶(FPS)和β-香树素合成酶(β-AS)是本合成途径的两个关键酶。本研究旨在利用生物技术手段从辽东楤木中分离FPS和β-AS两个关键酶基因,利用转基因技术转入大肠杆菌和酵母中实现异源表达。目标是从转目的基因的微生物中获得抗肝炎药物齐墩果酸,从而解决临床上对齐墩果酸的大量需求。本研究利用RT-PCR技术,首次在辽东楤木中克隆到法呢基焦磷酸合酶基因(FPS)和β-香树素合成酶基因(β-AS),GenBank的登录号分别是HM219226和HM219225,并对FPS和β-AS进行结构分析和功能验证。法呢基焦磷酸合成酶(FPS:EC2.5.1.1/EC2.5.1.10)位于三萜皂苷生物合成途径中游,催化五碳原子的异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲丙烯基焦磷酸(DMAPP)以“头-尾”连续缩合,形成15碳的法呢基焦磷酸(FPP)。FPS基因cDNA全长1040bp,其中包括1029bp完整的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF),推测编码342个氨基酸,通过DNAMAN与人参、三七等氨基酸序列比对发现,同源性达到80%以上。同时构建原核表达载体pET-28a-FPS,进行原核表达分析,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,诱导得到39.6kD的融合蛋白,由此表明FPS基因在E.coli BL21中获得成功表达。β-香树素合成酶(β-AS:EC5.4.99.B1)的作用位点在三萜皂苷生物合成途径的下游,将2,3-氧化鲨烯催化合成五环三萜类骨架β-香树素。此酶属于氧化鲨烯环化酶(OSC)家族。β-AS基因cDNA全长2292bp,其中包括2292bp完整的ORF,推测编码763个氨基酸,通过DNAMAN与人参、苜蓿、青蒿等氨基酸序列比对,同源性达到70%以上。同时构建原核表达载体pET-28a-AS,进行原核表达分析,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,诱导得到87.8kD的融合蛋白,由此表明β-AS基因在E.coli BL21中获得成功表达。将β-AS基因转入到Pichia pastoris中,进行基因功能验证。构建酵母表达载体pPIC9k-AS,表达产物经SDS-PAGE和Western blot检测得到87.8kD的诱导蛋白,说明β-AS基因在酵母中成功表达。应用HPLC技术,对转β-AS基因酵母的代谢目标产物鉴定检测,结果显示,β-AS在酵母中不但表达且具有活性,能够催化2.3-氧化鲨烯生成β-香树素。本研究利用Real-time PCR技术分析了辽东楤木法呢基焦磷酸合酶和p-香树素合酶基因在侧根、茎、叶和花器官中的表达差异。两个关键酶基因在茎、叶、花、侧根中均有表达,其中茎中的相对表达量最高,侧根中最低。