糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)为糖尿病严重的微血管并发症之一,其发病机制极为复杂,目前研究表明,视网膜在持续高糖环境的刺激下,可发生氧化应激、炎症反应、神经退行性改变和表观遗传学修饰异常等变化,它们之间相互作用并启动各自相关的信号通路,共同导致视网膜微血管病变的发生。根据视网膜血管病理改变的不同,可将DR的病程分为非增殖期和增殖期两个阶段。在DR非增殖期,病变主要表现为视网膜微血管内皮细胞结构损伤甚至丢失、周细胞凋亡、微血管细胞间紧密连接松弛、通透性增加等,进而引起血-视网膜屏障的破坏。在DR增殖期,大面积的毛细血管闭塞使视网膜局部严重缺氧,引起众多生长因子和炎症介质的上调,进而导致视网膜新生血管的形成。因此保护视网膜微血管的完整性、抑制视网膜新生血管形成是预防和治疗DR的关键。Roundabout 4(Robo4)是2002年被发现的Robo家族新成员,可特异性表达于血管内皮细胞的表面,具有调节内皮细胞通透性、影响新生血管形成等功能。近期研究发现,Robo4的表达变化与DR的发生发展密切相关。在体外低氧条件培养的人视网膜血管内皮细胞(human retinal endothelial cells,HREC)中,随着低氧作用时间的延长,细胞内Robo4表达逐渐升高,而抑制Robo4的表达可有效改善低氧诱导的HREC增殖和迁移能力的异常,且在体内糖尿病动物模型中,发现伴随DR的发生和病程延长,Robo4在视网膜内的表达水平逐渐增加。由此提示,Robo4在DR发生发展过程中可能发挥重要的作用,但与其相关的具体作用机制尚不清楚。在有关Robo4表达调控机制的研究中,利用基因启动子预测软件分析Robo4上游的启动子区域,发现其中存在多个specificity protein 1(SP1)的结合位点,且研究表明SP1作为常见的转录因子,可调控下游多个靶基因的转录而影响DR的发生发展,由此推测Robo4可能为SP1的另一靶向因子,在DR发病中,SP1通过调控Robo4的转录活性而影响视网膜微血管病变的发生。本研究于体内检测增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)患者纤维血管膜中SP1与Robo4的表达情况,并利用高糖条件培养HREC,以模拟DR的体内环境,探讨此时SP1与Robo4的表达水平及二者间的转录调控机制,并进一步探讨该机制在高糖条件下对HREC功能的影响。方法1.检测SP1与Robo4在PDR患者纤维血管膜中的表达情况收集临床中手术获取的PDR患者的纤维血管膜,对其进行HE染色,观察膜组织的病理结构,采用免疫组织化学染色法检测SP1与Robo4蛋白在纤维血管膜中的表达水平,并利用双重免疫荧光标记法检测二者表达的共定位情况。2.检测SP1与Robo4在体外高糖培养的HREC中的表达情况体外用高糖培养基培养HREC,利用RT-q PCR和Western blot法检测伴随高糖作用时间的延长,SP1与Robo4在HREC中m RNA转录和蛋白表达水平的变化。3.检测向HREC中分别转染SP1、Robo4小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)后SP1与Robo4的表达变化向体外高糖培养的HREC中转染SP1 si RNA以抑制细胞内SP1的表达水平,利用RT-q PCR法和Western blot法检测Robo4 m RNA转录水平和蛋白表达量的变化,同样方法转染Robo4 si RNA,观察其是否对SP1的表达水平亦产生影响。4.检测SP1与Robo4在HREC中的转录调控机制采用染色质免疫共沉淀技术(Ch IP)分别检测HREC在正常和高糖两种培养条件下SP1蛋白与Robo4启动子区的结合活性,并在Ch IP实验结果的基础上,利用荧光素酶报告基因系统(Luciferase Assay System)检测SP1蛋白与Robo4基因间的确切结合位点。5.检测SP1调控Robo4对HREC功能的影响向高糖条件培养的HREC中转染si RNA以抑制SP1与Robo4的表达水平,并通过Transwell法、细胞划痕法、单层细胞通透性实验和细胞管腔形成实验分别观察SP1/Robo4表达变化对HREC迁移、单层HREC通透性和管腔形成能力的影响。结果1.PDR患者纤维血管膜的病理组织结构主要分为四种类型:以增殖细胞为主要成分的膜组织、以新生血管居多的膜组织、新生血管破裂后红细胞大量溢出的血管膜与血管退化后以致密纤维组织为主要成分的纤维膜,SP1与Robo4在不同类型纤维血管膜中的表达均异常增高,且二者的表达共定位于纤维血管膜的微血管内皮细胞中;2.在体外高糖培养的HREC中,SP1与Robo4的m RNA转录与蛋白表达水平随高糖作用时间的延长呈同步性稳定增加;3.在高糖培养的HREC中,转染SP1 si RNA后,SP1的表达水平受到明显抑制,同时Robo4的m RNA和蛋白水平也显著降低,相反细胞内转染Robo4 si RNA仅能有效抑制Robo4的表达水平,对SP1的表达无显著影响;4.Ch IP结果显示在正常培养的HREC中,Robo4启动子-2400/-2700bp区域可与转录因子SP1相结合,而在高糖培养的HREC中,启动子-2400/-2700bp与-1800/-2100bp区域均与SP1有结合活性,Luciferase结果显示,HREC在正常条件下,SP1可与Robo4启动子区-2452/-2448bp位点结合调控Robo4的转录水平,而在高糖条件下,SP1可作用于Robo4启动子区-2452/-2448bp和-1912/-1908bp两个结合位点,进而增强Robo4的转录活性;5.高糖条件可引起HREC的迁移能力增强、单层HREC通透性增加和管腔形成能力下降,向细胞内转染SP1 si RNA或Robo4 si RNA后,HREC的迁移能力有所下降,单层HREC通透性显著降低,且HREC的管腔形成能力得到明显改善。结论本实验研究SP1与Robo4在DR发生发展中的作用及调控机制,发现SP1与Robo4在PDR患者的纤维血管膜内表达异常增高,提示二者可能参与纤维血管膜的形成,同时在体外高糖培养的HREC中,SP1与Robo4表达呈同步性上升,且下调SP1的表达可明显抑制高糖诱导的Robo4表达升高,说明SP1对Robo4表达存在一定的调控作用。进一步研究SP1与Robo4间的转录调控机制,发现高糖条件可诱导HREC中SP1过表达,并通过与Robo4启动子区-2452/-2448bp和-1912/-1908bp两个结合位点相互作用,从而增强Robo4的转录活性,提高Robo4的表达水平。且SP1/Robo4通路与HREC的功能密切相关,抑制SP1/Robo4的表达水平可显著改善高糖诱导的HREC功能异常,说明SP1/Robo4通路在DR微血管病变的发生中可能发挥一定的促进作用。