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禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus,a MPV)主要引起鸡和火鸡的上呼吸道感染,造成蛋鸡产蛋率和蛋品质下降。近年发现a MPV对番鸭等其它禽类也存在致病性。a MPV单一感染致死率不高,但会导致免疫力下降,继发其它疾病,增加死亡率。目前除大洋洲外均出现a MPV感染的报道,该病严重威胁了世界范围内的养禽业。血清学调查表明目前包括广西在内的多个地区养鸡场的鸡群普遍存在a MPV感染,且不同品种、性别和用途的鸡群均感染严重,部分种鸡群阳性感染率甚至达到100%。a MPV分离较为困难,其感染鸡的临床症状、解剖病变又与传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)和新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)相似,传统的病理解剖观察很难区分。此外,近年来a MPV、IBV和NDV混合感染呈多发态势。因此,建立同时检测a MPV、IBV和NDV的诊断方法和了解该病在鸡群的流行情况非常重要。本课题组前期已建立了a MPV的RT-PCR检测方法,因此,本研究在此基础上建立a MPV、IBV及NDV三重RT-PCR检测方法并应用于临床样品检测,同时原核表达了a MPV N蛋白中亲水性和抗原性较好的保守区,纯化后作为包被抗原建立能够检测a MPV特异性抗体的通用型间接ELISA方法,具体如下。一、a MPV、IBV及NDV的三重RT-PCR方法的建立和应用根据Genbank收录的NDV的F基因序列设计一对特异性引物,结合本课题组已设计的a MPV及IBV通用引物,建立了能够同时检测a MPV、IBV及NDV的三重RT-PCR方法。对扩增条件进行优化,特异性试验、敏感性试验和重复性试验等结果表明了方法的可行性。结果显示三重RT-PCR方法能够特异地扩增a MPV、IBV及NDV,而IBDV、ILTV、REV、ALV、MDV、MDPV、DHAV、FADV、DTMUV、E.coli、Salmonella等扩增结果均为阴性;所建立的三重RT-PCR方法最低检出限为1 ng/μL的c DNA;重复性试验结果表明该方法重复性良好。应用建立的方法对220份临床样品检测,结果a MPV检测阳性率为10.45%(23/220);IBV阳性率为56.4%(124/220);NDV阳性率2.7%(6/220)。本研究建立了高效快速、灵敏特异的针对a MPV、IBV及NDV的三重RT-PCR检测方法,为养禽生产中三种常见多发的呼吸道疾病的同步快速诊断和疫情的监控提供了有力的技术支撑。二、禽偏肺病毒N蛋白的原核表达根据生物信息学软件对a MPV N蛋白氨基酸序列保守性、二级结构及B细胞抗原位点进行预测,选取较为保守、亲水性、抗原性好的N基因部分片段连入表达载体p ET32a-1中,转化大肠杆菌DE3细胞进行IPTG诱导表达,优化条件后大量表达,利用Ni-NTA树脂进行纯化,SDS-PAGE电泳和Western blot结果显示成功表达了N蛋白。a MPV N蛋白在原核表达系统中的成功表达为a MPV快速诊断技术的开发及基因工程疫苗的研制奠定了基础。三、禽偏肺病毒N蛋白间接ELISA方法的建立及应用应用以上纯化好的重组N蛋白作为包被抗原,经过一系列的条件优化,初步建立了基于N蛋白的间接ELISA方法,所建立ELISA方法与NDV、IBDV、AIV、ALV、MDV、IBV等阳性血清均无交叉反应,批内重复性试验最大变异系数为6.20%,批间重复性试验最大变异系数为8.25%,均小于10%。应用建立的N蛋白间接ELISA方法与商品化试剂盒对326份血清样品进行平行检测,结果表明所建立的N蛋白间接ELISA方法与商品试剂盒符合率为95.4%。对广西地区规模化养殖公司鸡群共960份血清样品进行a MPV抗体检测,结果表明a MPV抗体阳性率为94.06%。本研究为a MPV ELISA检测试剂盒研制打下了基础,同时为a MPV的早期诊断与流行病学调查建立了技术平台。综上所述,本研究建立了高效快速、灵敏特异的针对a MPV、IBV及NDV的三重RT-PCR检测方法;设计并原核表达保守性、抗原性、亲水性良好的通用型N蛋白;并且基于此蛋白建立了间接ELISA方法。本研究为常见多发的a MPV、IBV及NDV混合感染的快速诊断、疫情监测提供了良好的技术平台,为a MPV的早期诊断和流行病学调查奠定了扎实的技术基础。