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蜚蠊是“四害”之一,可通过携带的病原菌威胁人类的健康。目前针对蜚蠊的主要防制手段为化学防制,但化学杀虫剂表现出抗药性、害虫的再猖獗和杀虫剂的残毒三大问题。生物防制具有不易产生抗药性、可自然传播、对害虫具有的一定的选择性和无污染等优点。苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)可在营养生长阶段分泌一类新型杀虫毒蛋白—营养期杀虫蛋白(Vips),由于少见耐药性报道是一种有潜力的杀虫蛋白,目前尚未见Vip3Aa蛋白在蜚蠊防制中的相关报道。在杀鳞翅目昆虫的机制中,Vip3Aa蛋白可被昆虫中肠蛋白酶切除N端序列形成活性蛋白。活性蛋白随后穿过围食膜,与中肠上皮细胞顶膜受体结合,导致中肠上皮细胞形成孔洞,最终导致昆虫死亡。N端序列对Vip3A蛋白活性的影响在不同昆虫中存在显著差异。目前针对Vip3Aa杀虫研究仍然处于针对其杀虫机理的研究,而缺乏对其相关分子机制的研究。在生物防制领域,由于蛋白质不稳定的特性,毒力蛋白一般通过构建转基因作物和微生物发挥使用功能。本研究中从Bt菌株中扩增获得vip3Aa基因,并设计新型N端截短vip3Aa基因(j-vip3Aa),通过原核表达系统成功制备和纯化了 Vip3Aa和J-Vip3Aa蛋白,生测活性显示Vip3Aa蛋白对美洲大蠊和德国小蠊均有杀虫活性。去除N端蛋白后,J-Vip3Aa的杀虫活性低于Vip3Aa蛋白,J-Vip3Aa对中肠消化液的敏感性高于Vip3Aa蛋白。HE染色和扫描电镜显示Vip3Aa可损伤美洲大蠊的中肠和柱状结肠,对嗉囊无影响。Vip3Aa蛋白可引起美洲大蠊解毒酶和蛋白水解酶的活性升高。Vip3Aa蛋白可被胰蛋白酶、美洲大蠊中肠消化液和胰凝乳蛋白酶水解为62 kDa左右蛋白。BBMV成孔实验显示Vip3Aa蛋白可在中肠和柱状结肠形成孔洞。荧光定位实验显示Vip3Aa蛋白和J-Vip3Aa蛋白在中肠和柱状结肠均无结合受体。美洲大蠊中肠转录组分析显示Vip3Aa蛋白给药后,其1539个基因表达上调,763个基因表达下调。通过对凋亡和溶酶体差异基因的分析,结合透射电镜和Hoechst染色结果,Vip3 Aa蛋白可能通过溶酶体-p38MAPK信号通路诱导美洲大蠊中肠上皮细胞的凋亡,从而发挥杀蜚蠊作用。以egfp为指示基因,构建了醋酸锂介导的绿僵菌芽生孢子转化法。vip3Aa基因导入绿僵菌后,杀美洲大蠊和德国小蠊活性分别增强了 3.75倍和4.13倍。初步尝试采用酵母展示系统制备Vip3Aa毒蛋白菌体,野生型酵母不具有杀蜚蠊活性,导入vip3Aa基因后可发挥一定的杀蜚蠊作用。综上所述,Vip3Aa蛋白具有杀蜚蠊作用。Vip3Aa蛋白杀蜚蠊机理不同于杀鳞翅目昆虫,Vip3Aa蛋白不需要切除N端序列即可直接发挥杀蜚蠊作用,且不依赖于和中肠或者柱状结肠受体结合。N端蛋白切除后,Vip3Aa蛋白活性下降,N端蛋白可用于保护Vip3Aa蛋白免受消化液的降解,延长Vip3Aa蛋白作用时间。Vip3Aa蛋白可能通过溶酶体-p38MAPK信号通路诱导美洲大蠊中肠上皮细胞的凋亡,从而发挥杀蜚蠊作用。Vip3Aa蛋白分别构建入绿僵菌和酵母后,可增强绿僵菌的杀蜚蠊活性,使不具有杀蜚蠊活性的酵母产生杀蜚蠊活性。通过上述研究有助于认识Vip3Aa蛋白杀蜚蠊作用及机制,通过和生防菌的结合,有望为蜚蠊的防制提供一种新的选择和一种新的研究思路。